基于完全人源肿瘤基质的三维球体侵袭实验

众所周知，肿瘤微环境是癌症生长和侵袭的重要组成部分。为了模拟癌变的进展过程，我们需要一种具有生物学相关性的人源肿瘤基质。这是目前唯一基于人源肿瘤基质的体外侵袭检测方法。

与传统的球体实验相比，该方法对温度的敏感性较低，且无需进行球体转移。该技术适用于头颈部癌等患者来源的实体癌样本，并可拓展用于包括放化疗在内的个体化治疗。这种基于人源肿瘤的基质已应用于多种实验，包括高通量药物筛选、活细胞分析、伤口愈合实验以及转移实验。

技术上最敏感的步骤是纤维蛋白原的处理方法，因此建议首先使用空孔练习此步骤。正确操作基质的方法非常重要，而通过直观展示该方法则易于分析。对于多细胞肿瘤球体的生成，将目标细胞系的1×10³个细胞溶于50 µL完全培养基中，分别加入96孔超低吸附圆底板的每个孔内。

然后将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育四天，随后使用倒置显微镜观察肿瘤类球体的形成情况。为建立三维类球体侵袭实验，将人源子宫肌瘤来源基质置于冰上解冻，同时将纤维蛋白原储存液在37摄氏度水浴中解冻。待试剂充分升温后，按适当体积混合完全培养基、人源子宫肌瘤来源基质、凝血酶、抑肽酶和纤维蛋白原，在将基质混合物加入细胞前再加入纤维蛋白原。

立即将50微升（µL）所得凝胶加入每个球体培养板孔中，移液枪头应朝向各孔内壁，缓慢移液，避免将球体从孔中心移开。由于纤维蛋白原在数分钟后开始凝胶化，因此需采用快速而精确的反向移液法，并且每次仅处理少数几个孔。将培养板放回细胞培养孵育箱中孵育30分钟，使来源于人子宫肌瘤的基质纤维蛋白凝胶充分固化，随后轻柔地向每个凝胶表面加入100微升（µL）完全培养基。

随后每天对类球体的侵袭情况进行成像。使用 ilastik 进行图像分割时，打开开源的图像分类与分割软件，选择像素分类工作流程，并将 ilastik 项目保存至计算机。

像素将根据用户所做的标注进行分类。点击“输入数据”和“添加新项”以选择用于分析的图像。进行特征选择时，点击“特征选择”并选择特征。

点击相应的方框以选择感兴趣的特征。所选方框将变为绿色。如需培训，请点击“培训”。

在训练部分，应有两个标签，标签1和标签2。使用其中一个标签标记背景，使用另一个标签标记细胞。当第一幅图像中的所有细胞和背景均已被标记后，从当前视图选择下一张图像，继续标记细胞和背景，直至完成全部图像的10%标记工作。

然后选择“实时更新”以分析所有图像。当训练完成后，ilastik 已分析所有图像，点击“预测导出”，并从“源”中选择“简单分割”。接着在“选择导出图像设置”中选择所需的输出文件格式，点击“全部导出”以导出标注结果。

文件将被导出到与原始图像相同的文件夹中。进行面积分析时，首先在 Fiji ImageJ 中打开带有比例尺的原始图像，并确保该图像的大小和尺寸与待分析图像一致。使用线条选择工具绘制一条已知长度的线段，然后点击“Analyze”（分析）并选择“Set Scale”（设置比例尺）。

然后在“已知距离”字段中设置已知距离。设置正确的单位，然后点击“全局”。要安装 ilastik 插件，请点击“帮助”和“更新”，在 ImageJ 更新器窗口中点击“管理更新站点”。

单击 ilastik 旁边的“下一步”，然后单击“关闭”和“应用更改”。几分钟后，将出现一个提示更新成功的信息窗口。单击“确定”并重新启动 ImageJ。

接下来，点击插件、宏，然后选择安装并选中 counter.ijm 文件，再点击打开。

完成区域分析后，点击插件并滚动选择 ilastik。选择导入 HDF5 并选择 h5 格式的文件。点击打开、加载并应用查找表。

然后点击键盘上的 A 按钮，该区域将作为总面积显示在摘要窗口中。在此代表性实验中，转移性喉鳞状细胞癌细胞系接种四天后，将基质添加到已形成的球状体上，并在倒置显微镜下每天监测其侵袭情况。一旦嵌入，人源子宫肌瘤来源的纤维蛋白基质中的细胞在一天后即开始迅速侵袭，并在接下来的两天内向基质中延伸。

在小鼠肉瘤来源的基质中，细胞未侵入周围基质，而是形成了一种不对称结构。在胶原基质中的细胞仅有轻微侵袭，但由于基质收缩，分析变得困难。在某些孔中，三维细胞球在三天后甚至完全消失。

此处展示了原发性和转移性喉鳞状细胞癌细胞在人源子宫肌瘤衍生的纤维蛋白基质中侵袭能力的定量分析。通过对人源子宫肌瘤衍生的纤维蛋白基质球体进行活细胞分析，可观察到细胞以条索状形式在基质中迁移，并随时间推移由其他细胞持续跟进。添加基质至孔板时，请注意避免移动球体，确保其始终保持在中心位置。

该方法可用于研究辐射及特定分子（如抗癌药物）对细胞侵袭的影响。细胞可经固定和染色后用于后续分析。在经典的小鼠肉瘤模型中，细胞主要表现为增殖，而侵袭性较弱。

这种基于人类肿瘤的基质可诱导侵袭，从而使抑制研究更加高效。