一种基于聚合酶链式反应的稳定检测方法，用于定量脆性X智力低下-1基因中的胞嘧啶-鸟嘌呤-鸟嘌呤三核苷酸重复序列

这种经济高效的方法可广泛应用于脆性X综合征（FXS）及相关脆性X障碍的分子诊断和筛查。该方法周转时间快，设备投入成本低。我们基于PCR的检测方法能够稳健地对FXS及相关脆性X综合征的全谱系突变进行分类，包括中间型、前突变型和全突变型，并实现快速报告结果。

该实验步骤将由新加坡珀金埃尔默公司的Weng Chua演示。首先从-20摄氏度冰箱中取出PCR缓冲液混合物、样本稀释液和DNA样本，在室温下放置20至30分钟使其解冻。使用试剂前，需涡旋振荡并短暂离心。

使用分光光度计测定DNA样本的浓度，如有需要，用样本稀释液将其稀释至每微升25纳克。标记PCR板上的孔位，以区分参考样本和待测DNA样本，并计算检测样本、参考样本及阴性对照样本所需的反应数。按每份反应加入15微升PCR缓冲液混合物、0.6微升样本稀释液和0.4微升聚合酶的比例配制PCR主混合液。

涡旋混匀混合物并短暂离心。然后将18微升混合物分装至每个孔中。再用移液器将每种DNA各2微升加入相应的孔中。

用移液器上下吹打混合试剂五次，然后密封反应板。将反应板放入热循环仪中，按照文稿中的说明运行PCR程序。提前将恒温振荡培养箱预热至65摄氏度，并向每份PCR产物中加入80微升1X TE缓冲液。

使用多通道移液器将样品转移至PCR纯化板中，并将该板放入振荡器。在65摄氏度下以1200转/分钟振荡孵育10分钟。孵育结束后，将振荡器温度冷却至25摄氏度，将真空装置设置为250毫巴，通过滤膜抽吸溶液。

15分钟后，孔内应无残留液体。关闭真空泵，向每孔中加入50 µL 1× TE缓冲液。使用先前的真空设置抽吸溶液10分钟。

将滤板底部用力压在叠好的纸巾上以干燥，然后向每个孔的底部中央加入 20 µL 1× TE 缓冲液。将板放入摇床中，在 25 °C、1200 RPM 条件下振荡孵育 5 分钟。孵育结束后，将至少 15 µL 纯化后的 PCR 产物转移至新的 96 孔 PCR 板中。

开始实验前，将DNA染料浓缩液、DNA凝胶基质、DNA标记物、DNA分子量标准品以及纯化的DNA样本恢复至室温。通过更换注射器并调节底板来设置上样工作站，然后松开注射器夹的杠杆，并将其滑动至顶部位置。启动片段分析软件，并配制凝胶染料混合液。

将染料浓缩液涡旋震荡10秒，然后离心沉降。接着，向凝胶基质小瓶中加入25 µL染料，并涡旋震荡溶液以混匀。将凝胶染料混合液转移至离心过滤器中，放入离心机，在1500 ×g条件下离心10分钟。

准备上样胶染料混合物时，将新的DNA芯片插入上样工作站，并向标记为G的孔中加入9微升胶染料混合物。关闭上样工作站，确保推杆位于1毫升刻度处。按下注射器推杆直至被卡扣固定，准确等待30秒，然后松开卡扣。

等待五秒钟后，缓慢将活塞拉回至一毫升位置。打开预热站，向标记为 G 的孔中加入九微升上样缓冲液混合物。向标记有梯形符号的孔以及每个样品孔（共12个）中加入五微升分子量标记物。向标记梯形符号的孔中加入一微升DNA分子量标记物，向每个样品孔中加入一微升PCR产物或水。

将芯片在2400 RPM下涡旋震荡一分钟。在五分钟内将芯片插入生物分析仪并运行。运行完成后，将峰数据导出为csv表格文件。

使用前突变女性样本和全突变女性样本作为参考样本。片段大小分析谱图中包含一个上游和一个下游标记峰，通常在约95个碱基对处出现引物复合物峰。这些参考样本用于构建回归标准曲线。

然后利用线性回归标准曲线计算未知样本的重复序列长度。该方法可正确分类临床正常、中间型、前突变、完全突变以及嵌合型完全突变样本。在某些情况下，微流控电泳结果中仅显示一个峰，这可能是由于存在正常的纯合等位基因所致。

一种非理想结果是基线偏差，其表现可能模糊或难以解释，并疑似由仪器故障引起。在进行该操作时，务必在开始实验方案前确保 DNA 的适量和高质量。可对 FMR1 基因进行测序，以鉴定 AGG 中断模式。

可以使用甲基化敏感性限制性内切酶或亚硫酸氢盐修饰检测来监测甲基化状态。这是一种快速、稳健且经济高效的技术，将有助于其他研究人员开展基于人群的脆性X综合征（FXS）及脆性X相关疾病携带者状态的研究。