适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

本方案可用于动物狂犬病的死后诊断，从现场初步观察到集中化水平的分子构象分析均可适用。快速免疫层析诊断检测是一种实用的替代方法，适用于非洲和亚洲等缺乏狂犬病诊断参考材料的农村及偏远地区。演示该操作流程的是我实验室的技术员 Simon Bonas。

本操作的第一部分将由来自马里巴马科中央兽医实验室的技术员 Ibrahima Dicko 演示。为暴露枕骨大孔，需使用刀具在第一颈椎前方切除动物头部，并使用适当的工具采集脑干样本。

例如一次性移液管、吸管、镊子或滴管，如图所示。脑干此时清晰可见，如图中移液管尖端所示。使用合适的工具（如吸管）采集部分脑干组织。

小心插入，并轻轻转动以采集脑组织。取出时切记用手指堵住吸管，以收集活检样本。也可使用钳子。

为了在枕骨大孔水平采集较大脑干组织，可选择使用试剂盒中提供的移液滴管直接采集脑干。类似于使用吸管的方法，将滴管在按压状态下小心插入，然后轻轻旋转以采集脑组织。

然后吸出脑组织并将其置于类似试管塞的容器中。在采样过程中，为获得准确诊断，必须采集包含延髓的脑干部分。将脑组织直接放入含有缓冲液的试管中，用拭子或滴管仔细研磨约30秒，直至形成均匀的悬液。

使用滴管，将四滴约100微升的悬浮液加入检测装置的样品入口。若因悬浮液黏度过高导致加入延迟，或为加速迁移过程的启动，可用滴管轻轻刮擦装置上样品滴加位置的底部。待样品完全迁移后，静置1至5分钟，再读取检测结果。

当出现两条线时，样本被视为狂犬病阳性；仅出现对照线时为阴性；若仅出现检测线或无任何线条可见，则结果无效。

为了从装置样本中提取RNA，需小心打开装置并取出滤纸。收集样本的沉积区域，并将样本放入1毫升的TriReagent LS中。在室温下定期轻轻手动振荡孵育一小时后，根据标准RNA提取方案，从管中上清液提取RNA。按照生产商的建议，加入2 µL糖原以促进RNA沉淀。

用无核酸酶水将RNA重悬液的终体积调整至50微升。并根据表格中的说明，配制三种不同逆转录定量PCR检测的预混反应液，使用表格中指定的引物和探针。

取5 µL稀释后的RNA样本，以及15 µL主混合液，分别加入相应的96孔反应板中，每种三个不同检测各设两个复孔。每块板中均需设置相应的阳性和阴性对照，各设两个复孔。

然后按照表格中所示的热循环条件进行不同的检测。结果可按照表格中的说明进行分析。脑组织活检的采集应尽可能简便，以确保获得高质量的样本。

与参考技术相比，采用这些方案的所有实验室中，快速免疫层析诊断试验的灵敏度和特异性均较高。根据累计检测样本数量，总体灵敏度和特异性均超过95%。快速免疫层析诊断试验适用于检测感染动物脑组织活检中的丽沙病毒。然而，由于丽沙病毒抗原水平对狂犬病诊断至关重要，因此在检测梯度稀释的病毒悬液时，其检测下限仍然较高。

在这些代表性结果中，通过针对丽沙病毒属病毒聚合酶的双重联合泛丽沙病毒逆转录定量 PCR 进行 RNA 检测后，共完成了 51 份阳性快速免疫层析诊断检测。此外，利用针对部分核蛋白基因的半巢式 PCR，可对其中 14 份样本进行基因分型。基于 RT-PCR 后的试纸条检测以及额外的长片段序列分析，可用于基因分型的诊断与提取。

快速免疫层析诊断试验可提供快速且准确的狂犬病诊断，这对于维持基于连续波的监测与控制系统中的波函数至关重要，并有助于最大限度地减少人为因素。