可点击笼锁化合物的设计、合成及其光化学性质
2019年10月15日
本文介绍了一种用于合成并测定具有可点击基团的模块化笼状化合物光化学性质的实验方案。
本实验的总体目标是提供一种实用方法，用于制备具有额外特性的光笼化合物，例如水溶性或细胞靶向能力。通过一种简单的合成步骤，该技术可用于拓展实验室中光笼化合物的种类，并在不牺牲其光敏性的前提下，制备出具有额外功能的光笼化合物。由于我们所使用的可点击光笼化合物在非亲核性有机溶剂（如二氯甲烷或二甲基亚砜）中溶解时对光照稳定，因此该合成可在标准实验室条件下进行。
本次实验操作由来自实验室的博士后研究员Akinobu Suzuki，以及研究生Hanami Aoki和Rei Watahiki在Hirona Sasaki的示范下进行。首先，在一个30毫升的圆底烧瓶中加入709.6毫克paBhc甲醇和397.6毫克N,N-羰基二咪唑。然后向烧瓶中加入6毫升无水二氯甲烷，并在室温下搅拌溶液一小时。
孵育结束后，加入342.8毫克4-二甲基氨基吡啶和552微升叔丁基六氨基己基氨基甲酸酯，于室温下继续搅拌反应液3小时。随后在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂及其他挥发性物质，并直接通过硅胶快速柱色谱法纯化残留物。为将功能单元引入可点击笼状化合物中，将249毫克五水合硫酸铜(II)溶解于10毫升去离子水中，配制成0.1摩尔的硫酸铜溶液。
将8毫克2'-叠氮基巴卡亭III、7.5毫克三(3-羟丙基三唑基甲基)胺、162.4毫克L-抗坏血酸钠和3.1毫克15-氯-3,6,9-三氧杂十五烷基叠氮化物溶解于2.5毫升0.1摩尔磷酸缓冲液和0.5毫升二甲基亚砜的混合溶剂中。随后，向反应混合物中加入81.2微升0.1摩尔硫酸铜溶液，在室温下搅拌反应80分钟，并通过高效液相色谱（HPLC）监测反应进程。反应结束后，用3.5毫升75%乙腈水溶液溶解析出的沉淀物，并将所得溶液直接上样至半制备型HPLC系统，以纯化目标产物。
进行量子效率测定时，在覆盖有紫外光截止滤光片的荧光灯下，将样品储备液用10微升二甲基亚砜稀释至10毫升KMOPS缓冲液中。取部分该溶液转移至化学光量计光反应所用的同一试管中。用350纳米光照射样品溶液5秒，并定期从被照射的溶液中取出50微升等分试样，用于高效液相色谱（HPLC）分析。
然后通过拟合起始物料随时间变化的消失曲线，确定起始物料反应90%所需的照射时间（单位为秒）。对于靶向可点击笼状化合物的HaloTag配体实验，使用适当的细胞解离试剂收集目标细胞群体，并将细胞重新悬浮于浓度为每毫升2.5 × 10⁵个细胞的DMEM培养基中。随后将约每皿10⁵个细胞接种至35毫米玻璃底培养皿中，在37°C及5%二氧化碳条件下过夜培养。
次日早晨，在含有700微升低血清培养基的1.5毫升微量离心管中，加入14微克PC DNA三卤化表皮生长因子受体质粒DNA进行稀释。接着，将5微升脂质体转染试剂加入150微升低血清培养基中，分别加入四个离心管中，并于室温下静置5分钟。孵育结束后，将150微升稀释后的质粒DNA分别加入已稀释的脂质体转染试剂样品中，再于室温下继续孵育5分钟。
孵育结束后，用每皿2毫升的PBS冲洗细胞，向每孔培养物中加入1.5毫升低血清培养基。向每皿中加入150微升质粒脂质体转染试剂复合物，将细胞放回细胞培养箱中继续孵育48小时。孵育结束后，吸除上清液，向每皿中加入1毫升新配制的DMEM培养基，其中添加2 µM paBhc hex fitzi halo。
在37摄氏度孵育30分钟后，吸除含有笼锁化合物的培养基，并用1毫升含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS plus）洗涤细胞两次，以去除未结合的化合物。每皿加入500微升低血清培养基，将细胞放回细胞培养孵箱中继续孵育30分钟，以清除进入细胞内的化合物。孵育结束后，每皿用1毫升含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS plus）洗涤细胞两次，然后向每孔培养物中加入1毫升不含酚红的培养基。
然后通过激光扫描共聚焦荧光显微镜记录荧光图像。若需使用可点击的笼锁化合物通过光照调控激酶定位，请在每个35毫米玻璃底培养皿中加入约5 × 10⁵个TOC-A-one细胞，每皿加入2毫升Ham's F12培养基。次日，按照前述方法，将编码GFP标记的二酰甘油激酶γ的质粒转染细胞，转染时间持续48小时。
转染结束后，将转染上清液更换为两毫升低血清培养基。向细胞中加入20微升100倍稀释的paBhcAA工作液，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5至60分钟。孵育结束后，将培养皿置于配备双光源荧光照明装置的倒置荧光显微镜的物镜载物台上。
根据实验方案，在适当的实验时间点和波长下照射细胞，同时每10秒对细胞成像一次，持续10分钟。采用本方法，如紫杉醇和花生四烯酸等一些具有生物学意义分子的可解笼化合物可被成功合成。通过铜催化的环加成点击反应，可将水溶性及细胞靶向能力等其他特性引入paBhc模拟紫杉醇分子中。
这些可点击的笼状紫杉醇可在350纳米光照下发生光解，生成其母体化合物。可点击笼状化合物的物理和光化学性质已在表格中总结。在活细胞实验中，paBhc hex fitzi halo 能靶向瞬时表达HaloTag蛋白和表皮生长因子受体的培养哺乳动物细胞，并在细胞膜上产生来自荧光素部分PAHBHC hex fitzi halo的绿色荧光信号。
此外，用花生四烯酸处理瞬时表达GFP标记的二酰基甘油激酶γ的CHO-K1细胞，会导致二酰基甘油激酶γ亚细胞定位的改变。在经paBhc-AA处理并暴露于紫外光的细胞中，也可观察到二酰基甘油激酶γ定位的类似变化。在水溶液中进行笼锁实验并逐步增加培养基时，务必始终在配有短波长截止滤光片的荧光灯下操作。
通过该实验步骤，您可以研究那些因缺乏水溶性、膜通透性或细胞靶向能力而在生物学实验中长期受限的笼锁化合物。
概述
本文介绍了一种合成含可点击基团的模块化笼状化合物的方案，并着重阐述其光化学特性。该方法旨在增强笼状化合物的功能性，同时保持其光敏性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 化学
- 光化学
背景
- 光笼化合物是神经科学中用于控制细胞过程的重要工具。
- 提高水溶性和靶向能力等性质可拓展其应用范围。
- 合成可在标准实验室条件下进行，确保方法的可及性。
- 在光照条件下保持稳定的化合物对实验的可靠性至关重要。
研究目的
- 提供一种制备光笼化合物的实用方法。
- 在不损害笼状化合物功能性的前提下，为其引入额外的特性。
- 促进这些化合物在多种生物应用中的使用。
使用的方法
- 使用特定试剂和条件合成可点击的笼状化合物。
- 通过硅胶快速柱色谱法纯化产物。
- 通过高效液相色谱分析测定量子效率。
- 利用共聚焦荧光显微镜进行细胞靶向与成像。
主要结果
- 成功合成了具有所需特性的模块化笼状化合物。
- 证实了化合物在不同条件下的稳定性。
- 利用合成的化合物实现了对细胞的有效靶向。
- 实现了光化学特性的定量测量。
结论
- 该方案可实现功能化笼锁化合物的高效合成。
- 性能的提升可拓展其在神经科学研究中的应用范围。
- 该方法可适用于生物学研究中的多种实验设置。
常见问题
行业重要性概述
扩大笼状化合物的结构多样性可解决活细胞应用中的一个关键瓶颈，实现对生物活性分子的精确时空控制。该模块化可点击平台能够快速引入靶向基团或增溶基团，同时不降低光解效率，从而提高探针设计的可预测性。这一方法通过提供化学上多样化的工具，助力早期发现阶段的机制性风险消除，促进靶点验证和检测方法的开发。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过光控释放紫杉醇或花生四烯酸等生物活性化合物，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：可在活细胞中精确控制化合物活性的时间进程，支持功能靶点的验证。
- 预测价值：所提供的笼锁型化合物相较于传统的2-硝基苄基笼锁结构具有更高的光解量子产率，有助于提高先导化合物的识别效率。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可定量测量的光化学输出（例如，光解量子产率），用于检测标准化。
- 操作价值：产生可溶于水且可靶向细胞的笼状化合物，适用于水相筛选缓冲液。
- 平台价值：通过一价铜催化的Huisgen环加成反应实现可扩展合成，支持化合物库的扩展与重复利用。
转化与临床前研究
- 转化价值：已证实的细胞靶向能力（例如 HaloTag 配体）可支持与疾病相关的系统建模。
- 机制性风险降低：光激活后可确认亚细胞定位的调控（例如 二酰基甘油激酶γ），从而将化学探针与表型结果关联起来。
- 预测可靠性：在非亲核性溶剂（例如 DMSO、DCM）中稳定的化合物可确保在临床前工作流程中可靠储存和操作。
流程与工作流整合
该方法通过实现多样化笼锁化合物的快速合成，用于靶点结合研究，并将结果输入先导化合物筛选和临床前验证，从而整合到早期发现工作流程中。
- 发现生物学：通过激酶调节剂和脂质信号分子的时空控制，促进假设验证。
- 筛选：提供即用型化合物，具有水溶性和靶向特性，可在细胞系统中进行可靠的化合物评估。
- 分析：基于HPLC定量光解动力学和量子产率，实现客观的性能比较。
- 转化研究：在活体哺乳动物细胞中通过已验证的靶向性和光解激活，支持从发现到临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可模块化适配多种生物活性分子（如紫杉醇、花生四烯酸）的平台，适用于不同项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在复杂的生物系统中实现对笼锁化合物的精确光依赖性激活，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的合成与纯化流程（硅胶快速柱色谱、HPLC 验证）确保实验的可重复性。
- 战略价值：通过生成具有更优理化性质（如溶解性、靶向性）的化合物，降低研发过程中的淘汰风险，从而优化“继续/终止”决策。
- 项目组合影响：基于已验证的光化学性能和细胞相容性，实现对化学探针的风险校准优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备有机合成、点击化学和光化学表征方面的专业知识。
- 需要配备高效液相色谱仪（HPLC）、荧光显微镜以及标准的有机合成设备（旋转蒸发仪、柱色谱）。
- 要求跨团队统一铜(I)催化环化反应条件和纯化方案，以确保实验一致性。
- 在引入多种功能单元（胺基、羟基、羧酸酯）时，需进行适应性测试，以维持光解效率。
- 实际限制：由于溶剂可能影响光解动力学，必须在水相培养基中验证其性能。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Clickable Caged Amine Preparation
1:53
Functional Unit Installation
3:12
Quantum Efficiency Measurements at 350 nm
3:59
HaloTag Ligand Targeting
6:28
Photomediated Kinase Localization Modulation
7:33
Results: Physical, Photochemical, and Functional Properties of Clickable Caged Compounds
9:05
Conclusion
