成像与分析发育过程中组织方向性与生长动态 黑腹果蝇 蛹期上皮组织

在多细胞生物中，组织在空间取向上表现出高度的有序性。在形态发生过程中，细胞会在较大距离范围内有序排列并呈现特定的方向性。为了理解上皮细胞在发育过程中如何形成平面排列，至关重要的是在活体条件下以高时空分辨率追踪细胞的取向及其生长动态。

本方案旨在对果蝇蛹表皮细胞在全局和局部水平上的行为进行成像与分析。该方法可为细胞生物学、形态发生及平面极性等不同理论研究领域提供见解，并可应用于其他组织、结构和模型的分析。经过一定练习后，所有步骤均可轻松完成。

它们要求精确。通过可视化本方案，有助于在更短时间内获得最佳结果。蛹的解剖过程较为复杂。

首先，使用湿润的画笔将处于特定发育阶段的白色未成熟蛹转移到新的塑料小瓶中，并在25摄氏度下根据需要保持一段时间。然后，借助镊子将每个蛹从瓶壁上取下。将每个蛹的腹面粘附在覆盖有双面胶带的玻片上。

用镊子尖轻轻敲击头部气门和蛹的背侧表面，以确保蛹壳与胶带粘附牢固。在体视显微镜下开始解剖，用镊子轻轻移除蛹壳上的气门盖。将镊子的一端从气门盖开口处插入蛹壳与蛹体表面之间的浅层间隙中。

从头到尾横向撕开蛹壳，操作一至多次，注意避免夹伤蛹体。随着操作向后端推进，将裂开的蛹壳向两侧翻折。用镊子小心地从动物体下方插入，轻轻向上提起，将蛹从打开的蛹壳中取出。

蛹会粘附在镊子的尖端。轻轻握住蛹的腹面，将其转移到含有少量透气性卤代烃油的玻璃底培养皿中。将湿润的纸巾卷成条状置于培养皿边缘，盖上盖子以保持湿度。

根据需要评估的结构域和过程，将蛹放置在玻璃底培养皿的油滴上并调整其方向。若需对背侧巢的早期扩展进行长时间活体成像，应将蛹以背侧朝向侧面的方向定位；若需成像其晚期扩展及组织重塑过程，则应将蛹以背侧朝上的方向定位。

将装有固定蛹的玻璃底培养皿转移至显微镜载物台上，使用透射光聚焦于腹部区域表面。为了利用有丝分裂重组在腹部上皮中诱导遗传嵌合体，需准备携带热激可诱导的翻转酶（flipase）、在特定基因组位置具有FRT位点以及在FRT位点远端带有可识别细胞标记的处女雌蝇。同时准备在相应基因组位置携带FRT位点的突变雄蝇。

将多只雌性和雄性果蝇以三比一的比例在塑料小瓶中于25摄氏度下杂交4至5天。为在组织母细胞中产生体细胞克隆，于杂交后代的三龄幼虫阶段进行热激处理：将装有实验动物的塑料小瓶浸入37摄氏度的水浴中，持续45分钟至1小时。在ImageJ软件中，使用最大强度投影功能，将共聚焦显微镜获取的Z轴层叠图像以二维形式保存。

巢具有特征性的形状，使其在平面坐标系中定向为左侧为前，上侧为背。为了使该分析获得最佳结果，输入图像必须以高分辨率获取。要获得局部细胞边缘的定性取向值，请点击插件菜单并选择取向J分布选项。

将高斯窗口sigma设为1像素，三次样条设为梯度，最小一致性设为20%，最小能量设为1%。使用插件的颜色调查选项，将色调设为取向，饱和度设为一致性，亮度设为输入图像。

此方法根据设定的平面坐标系对细胞边缘方向进行颜色编码。接下来，在插件菜单下，使用“方向J测量”选项来量化细胞的取向以及细胞间的方向性排列。在组织母细胞占据的区域内，生成大小相近、相邻且不重叠的、权重均匀的兴趣区域，每个区域约为20微米×20微米。

按压测量可从感兴趣区域（ROIs）计算出主要的局部取向性和一致性。本研究采用的方法能够在长达48小时的时间内生成发育中蛹的高分辨率动态图像，且无明显光漂白或光毒性。此处展示了在蛹壳形成后26小时，由RFP-NLS缺失标记的野生型克隆及其孪生斑点的示例。

克隆沿体节边界伸长。双克隆呈平行或串联排列。野生型克隆在蛹化后26小时和47小时的形态显示，两个阶段均具有复杂的边界形态。

蛹壳形成后26小时和47小时的几何参数箱线图显示，在此时间窗口内，平均面积和周长显著增加。克隆的取向在扩展和重塑过程中保持稳定。蛹壳形成后26小时和47小时的形态参数表明，野生型克隆的粗糙度、圆形度和圆度几乎未发生变化。

务必注意不要损伤蛹，否则它将在几小时内死亡，影响活体成像。本方案无需使用任何萨托氏试剂或仪器。解剖时避免夹伤自己。

通过应用这些方法，可利用不同的成像技术（如点光源成像或转盘式共聚焦显微镜）实现长期、高分辨率的动态成像。氯醛分析可用于研究非自主性响应，因为随机细胞有助于识别细胞间的串扰或细胞通讯机制。

这些方法可轻松地加以调整，用于研究一系列形态发生现象，包括变态过程中表皮、肌肉和神经发育的协调。