利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

本文所述方案旨在演示利用体内癌症模型测试治疗有效性的算法。该方案结合了多种技术。通过对人类肿瘤标本进行全基因组生物测序，以鉴定基因组变异。

这些改变包括基因重排和基因拷贝数变化。因此，需对已鉴定的改变进行分析，以筛选出可能具有药物靶向性的变化。随后，根据基因组分析结果选择的药物将用于治疗在免疫缺陷小鼠体内生长的相应肿瘤。

所开发的算法为癌症患者治疗决策的制定提供了一种颇具前景的辅助方法。使用Panda工具或类似软件来识别可靶向的基因变异。我们可将通过微测序技术鉴定出的基因，以标准公认的基因符号列出，并生成一个简单的制表符分隔文件。

在列表的标题行中添加井号符号（#），以确保表格标题被传输至软件的通路层级 U。通过点击相应的导航选项卡上传文件。通过点击所选图标，然后点击“完成”选项卡，为底层数据分配一个单独的图标以进行表示。

患者文件上传后，预览页面以确定显示每条通路中注释基因数量的列，该列为最右侧的最后一列。在主窗口左上方使用通路筛选器，将显示的通路数量限制为包含目标基因的通路。

为了鉴定出比随机预期含有更多注释基因的通路，请使用“富集”选项卡下的功能。随后，主表格中将添加一列，显示来自费舍尔精确检验的相应 p 值。通过在主窗口左侧勾选相应图标，选择数据库以显示预设注释中的潜在可药靶基因。

要选择通路进行可视化，请点击通路查看器页面中显示的通路名称。每个注释集对应的图标会显示在相关基因的旁边。点击通路中的任意基因，将打开相应的基因卡片页面。

选择含有目标基因注释及潜在药物作用靶点的信号通路，用于进一步分析。在层流罩中进行组织操作，以维持无菌条件。将肿瘤组织置于含有冷的PBS或含抗生素的组织培养基（如RPMI、DMEM）的培养皿中。

在病理学家的协助下，识别并分离出有活性的肿瘤组织，去除邻近的正常组织和坏死组织。使用无菌镊子和手术刀，根据病理学家指出的区域，去除坏死组织。进行皮下移植时，用无菌镊子、手术刀或手术剪将肿瘤组织切成约 2 x 2 x 2 毫米大小的小片段。

将破碎的组织转移至预冷的、置于冰上的培养皿中。向培养皿中加入冰冷的Matrigel，每10块组织约加入200 µL。充分混匀，使组织碎片在Matrigel中浸泡10分钟。

使用无菌手术剪和镊子在小鼠双侧 flank 区域做一道 5-10 毫米的纵向皮肤切口。将直镊轻轻插入皮下间隙，创建一个足够大的囊腔，以便将肿瘤组织片段置于脂肪垫下方。使用无菌直镊将肿瘤组织片段插入先前在五只小鼠中分别制备好的囊腔内。

使用组织胶水闭合皮肤切口。植入后，为抑制淋巴细胞增殖，每只小鼠注射 100 微升利妥昔单抗。通过捏住小鼠背部皮肤并向后弯曲，使其头部和嘴唇固定，以准备进行口服灌胃。

将灌胃探针沿小鼠咽喉后壁插入，直至探针进入食管。注意探针插入深度不可过深，以免刺穿小鼠肺部导致死亡。代表性基因组浮点图展示了单个肿瘤中基因组改变的整体图景。

对于高级别浆液性肿瘤而言，通常可检测到多处获得（蓝色线条）和缺失（红色线条），表明基因组高度不稳定。OC101肿瘤中最具治疗干预意义的首要变异趋势是17号染色体上的扩增，涉及ERBB2基因，该基因编码HER2受体。为了在DNA水平上验证这些结果，针对扩增区域边缘设计了多组特异性引物。

随后进行PCR反应。当使用对照人DNA时，未检测到扩增产物。在OC101肿瘤DNA中鉴定出特异性条带。

在另一种变异肿瘤T14中，观察到大量的DNA扩增，其中包括AKT2和RICTOR基因。在蛋白质水平上通过免疫印迹进行的验证显示，AKT和RICTOR的表达水平较高。

在第六周末，化疗治疗组的肿瘤负荷显著降低。接受联合治疗的组别相较于单独化疗显示出额外的治疗益处。在治疗试验结束时，采集肿瘤组织以进行治疗反应的分子分析。

使用免疫印迹法检测S6、AKT和mTOR的总蛋白水平及其磷酸化水平。比较未经处理、化疗药物处理以及AKT或mTOR抑制剂处理的样本中这些蛋白的水平，结果显示后两种处理组中蛋白水平显著降低。该方法对于在PDX模型中开展临床试验具有重要价值。

它利用基因组分析所获得的肿瘤分子特征，来确定最适合用于测试的药物。