仿生柔性机器人集成微电极

我们提出了一种新型电控仿生驱动器的制备方法，该方法不仅能够克服现有生物杂合驱动器的局限性，还可显著提升基于细胞的驱动器性能。利用这种低成本且易于操作的技术，可实现对仿生软体机器人驱动行为的控制与调节，从而实现实时刺激。该新方法有望进一步拓展应用于无线供能的可植入柔性电子器件，以促进心脏再生。

该方法还可作为研究细胞潜伏结构局部电刺激的新型平台。首先，将80毫克GelMA溶解于4毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。然后加入20毫克羧基功能化的多壁碳纳米管，并在660毫赫兹和100瓦条件下超声处理该溶液1小时。

为了制备微图案化的 PEGDA，将一层厚度为 50 微米的商用透明胶带贴在经 TMSPMA 涂覆的玻片上，在涂覆面滴加 15 微升 20% PEGDA 预聚物溶液，然后覆盖上金微电极。将第一块光掩模置于玻片上方，将整个装置暴露于 200 瓦、强度为 800 毫瓦、距离为 8 厘米的紫外光下照射 110 秒。紫外照射结束后，将玻片放入杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中。

在间隔物之间加入20微升碳纳米管GelMA预聚物溶液液滴。5到10分钟后，小心地将微图案化PEGDA水凝胶和金微电极从未涂层的玻璃基底上剥离，并将载玻片倒置放置在间隔物上。用胶带将载玻片固定在培养皿上，然后将整个装置倒置。

将第二块光刻掩模放置在玻璃载片上，并按照演示方法用紫外光照射200秒。照射结束后，用新鲜的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）清洗支架一次，再用添加了10%胎牛血清的细胞培养基清洗一次。然后将支架放入新的培养皿中的新鲜培养基内，置于37摄氏度培养箱中过夜。

根据标准方案从两天龄新生大鼠心脏中分离心肌细胞后，将细胞重悬于浓度为1.95 × 10⁶ 个细胞/毫升的心脏培养基中，并以液滴形式接种至制备好的软体机器人表面。当装置的整个表面被细胞覆盖后，在37°C下培养样品5天，并在接种后的第1天和第2天，用5毫升新鲜细胞培养基（添加2%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺）更换培养上清液。为评估心肌细胞在软体机器人上的自发搏动，自培养第3天起，将机器人置于倒置光学显微镜载物台上，使用5X或10X物镜及视频采集软件，以每秒20帧的速度连续成像心肌细胞活动30秒。

第五天，使用盖玻片轻轻抬起膜的边缘。使用间距为三厘米的PDMS作为支架，将两个带铂丝的碳棒电极固定在盛有心肌培养基的六厘米培养皿中，并小心地将软体机器人转移至该培养皿内。随后施加方波刺激，脉冲宽度为50毫秒，直流偏移值为零伏，峰值电压幅度介于0.5至6伏之间。

使用金微电极进行电刺激时，在制备多层结构后，通过外部的方形端口，用银浆将两根铜导线连接至金电极，并用一层在80摄氏度下预固化5分钟的PDMS覆盖银浆。随后将样品置于45摄氏度的加热板上5小时，以实现PDMS的充分交联。在将心肌细胞接种到连接导线的软体机器人上后，通过铜导线施加方波电刺激，直流偏置电压为1 V，峰值电压幅度在1.5至5 V之间，频率分别为0.5 Hz、1 Hz和2 Hz。

这些软体机器人通过仿生模拟两种不同水生动物——海星和蝠鲼的运动模式而设计。根据图案间距的不同，接种心肌细胞的碳纳米管 GelMA 层表现出不同的搏动行为。为了防止心肌细胞在动态搏动过程中导致软体机器人发生不可逆的完全卷曲，将 PEGDA 水凝胶支撑层的图案间距优化为 300 微米。

从收缩记录获得的这些帧中，可以清楚地观察到，当翅膀在中间有力闭合时，尾部通过伸直来平衡结构，而形似魔鬼鱼的驱动器则按预期弯曲翅膀。部分膜在收缩时表现出旋转运动，这是由于微图案化的碳纳米管 GelMA 和 PEGDA 水凝胶排列不齐所致。通过 F-肌动蛋白 DAPI 共聚焦成像，也可观察到微图案化 PEGDA 和碳纳米管 GelMA 图案上的心肌组织。

通过共聚焦显微镜，可以在图案化区域观察到部分单轴排列的肌节结构以及相互连接的肌节结构，同时在直接位于微电极上方的心肌组织中也能观察到良好互联的肌节结构。通过连接至金电极的外部碳电极或铜线施加不同频率的电刺激时，其激发阈值电压有所不同。采用光掩模对 PEGDA 和 GelMA 进行紫外光交联及微图案化处理，对于获得高质量、包含多层覆盖结构的金微电极至关重要。

生物打印可用于制造微图案化水凝胶和柔性电极。我们利用生物打印技术快速、低成本且高通量地获得了几何结构明确的软体机器人。通过将柔性电子器件直接集成到基于水凝胶的支架中，该方法有望推动软体机器人的无线电刺激技术的发展。

碳纳米管和有机溶剂应始终在通风橱内操作，因为碳纳米管纤维可能进入肺部，增加患癌风险。