联合条件性敲低与改良的成球实验用于研究患者来源的胃癌干细胞中与干性相关基因的功能
2020年5月9日
在本实验方案中，我们介绍了一种利用条件性敲低系统和改良的成球形成实验来研究簇集素（clusterin）对患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）干性影响的研究设计。该方案可轻松调整，用于研究不同类型肿瘤干细胞（CSCs）中与干性相关基因的体外和体内功能。
癌症干细胞与癌症复发、转移及药物耐药性密切相关。本方案提供了一种高效研究癌症干细胞中关键基因功能的方法。通过条件性基因敲低系统并结合改良的成球形成实验，该方法可便捷地用于研究不同类型癌症干细胞中干性相关基因在体外和体内的功能。
演示该实验操作的是本实验室的研究助理 Yuting Li 和 Xiangyu Tan。为产生慢病毒颗粒，将四百万个 293T 慢病毒包装细胞接种至直径 100 毫米的培养皿中，加入含 10% 胎牛血清（FBS）的 10 毫升 DMEM 培养基。将细胞在 37°C 及 5% 二氧化碳条件下培养过夜，确保转染当天细胞融合度达到 50% 至 80%。
将低血清培养基恢复至室温，并根据文稿说明准备 A 管和 B 管。将 A 管中的内容物加入 B 管中，充分混匀，室温孵育 15 分钟以制备脂质-DNA 复合物。从细胞培养皿中移除 5 mL 培养基。
然后将5 mL脂质-DNA复合物逐滴加入细胞培养皿中，并轻轻摇晃培养皿。将培养皿在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。孵育结束后，小心移除转染培养基，并加入10 mL预热的含10% FBS的DMEM培养基。
将细胞继续孵育24小时。转染后约48小时，收集含有慢病毒的上清液10毫升，并使用0.45微米的滤器过滤，以去除细胞碎片。所有细胞培养容器、枪头、滤器和注射器可能含有慢病毒，废弃前应使用10%漂白液处理。
将澄清的上清液转移至无菌容器中。加入Lenti-X浓缩剂，并轻轻颠倒混匀。将混合物在4°C下孵育过夜。
第二天，在 4°C 条件下以 1500 × g 离心样品 45 分钟。小心移除上清液，注意不要扰动底部的沉淀。将沉淀轻轻重悬于 1 毫升添加了 10% FBS 的 DMEM 中，并于 -80°C 保存。
将600万个胃癌干细胞（GCSC）接种至100毫米的培养皿中，加入10毫升含10% FBS的DMEM培养基。于37°C、5% CO₂条件下培养24小时。当细胞融合度达到70%至80%时，吸去培养皿中的培养基，加入用4毫升含Polybrene试剂的完全DMEM培养基稀释的浓缩慢病毒颗粒。
将细胞放回培养箱中孵育18小时。应测试不同条件下聚凝胺的有效浓度，其通常在每毫升2至10毫克的范围内。18小时后，更换为10毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，并将细胞放回培养箱中继续孵育24小时。
然后，吸除含有细胞碎片的上清液，加入新鲜的DMEM培养基，该培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和2.5微克/毫升嘌呤霉素。将细胞再孵育24小时。随后，更换培养基为新鲜的DMEM，其中添加10%胎牛血清（FBS）和5微克/毫升嘌呤霉素。
再次培养24小时后，用5毫升不含钙和镁的DPBS冲洗贴壁的GCSCs两次。加入1毫升预热的细胞解离液解离细胞，并在37摄氏度下孵育2至3分钟。然后，向细胞悬液中加入5毫升新鲜预热的GCSC完全培养基。
取三毫升该悬液加入15毫升离心管中用于冷冻保存，另取三毫升加入另一管中用于多西环素诱导。将两管均在800 × g离心5分钟。然后吸除B管中的上清液，并将细胞重悬于一毫升新鲜预热的GCSC完全培养基中。
将适量细胞接种至新的100毫米培养皿中，加入10毫升新鲜预热的GCSC完全培养基和2.5微克/毫升多西环素。然后将培养皿孵育48小时。使用自动细胞计数仪测定10微升细胞样品的密度。
然后，用预热的GCSC完全培养基调整体积，使细胞浓度为每毫升20,000个活细胞。将100微升细胞悬液加入新的超低吸附96孔培养板的每个孔中。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下培养。
肿瘤球的形成应在3至10天内发生。每两天对肿瘤球的形成情况进行成像观察。原发性人胃腺癌中的胃癌干细胞在无血清培养基中进行培养。
培养六天后，细胞从单细胞样表型扩展形成较大的球状结构。为评估簇集素（clusterin）在胃癌干细胞（GCSCs）中的功能，将靶向簇集素的短发夹RNA序列克隆至Tet-GV307-RFP-Puro载体中。转染表达载体的细胞用多西环素处理48小时。
随后，通过蛋白质印迹法检测 clusterin 的表达，并通过密度测定法进行定量。在胃癌干细胞（GCSCs）中，强力霉素的存在以及 clusterin 的敲低抑制了肿瘤球体的形成。而在转导了乱序 shRNA 对照的细胞中，未观察到肿瘤球体形成受到抑制，表明强力霉素本身并不抑制肿瘤球体的形成。
这些结果表明，在 clusterin 沉默后，胃癌干细胞（GCSCs）生长缓慢，且无法形成肿瘤球。根据这些数据，clusterin 在促进胃癌干细胞自我更新活性中发挥关键作用，提示其可能是抑制胃癌患者癌症干细胞的一个有前景的药物靶点。肿瘤球应为单个或聚集细胞上形成的实心圆形结构，非此类结构不应视为肿瘤球。
然而，某些肿瘤干细胞可能无法形成典型的肿瘤球结构。该实验步骤可与其他方法结合使用，以体外检测肿瘤干细胞的自我更新潜能。例如，可检测干细胞相关标志物的表达情况。
该方案可进一步拓展用于研究关键基因在肿瘤干细胞中的功能，例如干性对存活的影响。
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概述
本方案介绍了一种利用条件性敲低系统和改良的成球形成实验来研究簇集素（clusterin）对患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）干性影响的实验设计。该方法可轻松适用于多种癌症干细胞中与干性相关基因的体外和体内研究。
关键研究要素
科学领域
- 癌症生物学
- 干细胞研究
- 基因功能分析
背景
- 癌症干细胞（CSCs）在癌症复发和转移中起重要作用。
- 了解特定基因在癌症干细胞中的作用对于开发靶向治疗策略至关重要。
- 本实验方案聚焦于clusterin基因及其对干性的影响。
- 该方法可灵活应用于不同类型的癌症研究。
研究目的
- 研究簇集素（clusterin）在患者来源的胃癌干细胞（GCSCs）干性中的作用。
- 提供一种研究干性相关基因的可靠方法。
- 加深对肿瘤干细胞（CSC）生物学特性及潜在治疗靶点的理解。
使用的方法
- 用于基因沉默的条件性敲低系统。
- 改良的成球实验以评估干性特征。
- 体外与体内实验设计。
- 利用慢病毒颗粒进行基因递送。
主要结果
- 演示了生成慢病毒颗粒的实验步骤。
- 揭示了簇集蛋白（clusterin）对胃癌干细胞（GCSCs）的影响。
- 展示了该方法适用于多种肿瘤干细胞（CSC）类型的可扩展性。
- 强调了研究干性相关基因的重要性。
结论
- 该方案适用于研究簇集素在肿瘤干细胞中的作用。
- 可针对不同类型的肿瘤干细胞进行适应性调整。
- 本研究可能为癌症治疗策略提供新的见解。
常见问题
行业重要性概述
本方案可实现对患者来源的胃癌干细胞中与干性相关基因的机制性去风险化，支持肿瘤学发现中的靶点验证。通过将条件性基因敲低与改良的成球形成实验相结合，该方法可提供定量且可重复的读数，用于评估基因在癌症干细胞特性通路中的功能。该策略可提高胃癌治疗药物在早期靶点筛选和项目组合优先排序中的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将簇集素（clusterin）基因敲低与球体形成减少相关联，阐明其在胃癌干细胞自我更新中的作用，从而验证治疗假设。
- 操作价值：在与疾病相关的体系中实现可诱导且可逆的基因沉默，从而进行功能性靶点验证。
- 预测价值：通过体外实验证明抑制簇集素可损害肿瘤形成潜能，支持临床前“推进/终止”决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：生成标准化、可量化的球体形成指标，适用于高内涵筛选的适应。
- 可重复性：采用慢病毒递送和嘌呤霉素筛选，确保不同实验间基因敲低效率的一致性。
- 可扩展性：兼容96孔超低吸附板，可平行测试多种基因扰动。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：采用患者来源的胃癌干细胞，保持与人类肿瘤生物学表型的高度一致性。
- 转化连续性：将体外干细胞特性评估与簇集蛋白作为治疗靶点的潜在体内验证相衔接。
- 风险调整后的进展：提供机制性证据，以在针对癌干细胞驱动的复发和耐药的临床前研究管线中优先推进簇集蛋白的研究。
流程与工作流整合
该方法适用于从发现到临床前研究的连续过程，可在肿瘤学项目中初步确定命中靶点后、先导化合物优化前，进行靶点验证。
- 发现生物学：通过类球体形成将基因敲低与功能性干性表型关联，支持假设验证。
- 筛选：生成基于成像的定量读出结果，可用于化合物或遗传抑制子筛选的自动化分析。
- 分析：支持对Western印迹进行密度分析及类球体定量，以实现不同遗传条件下结果的客观比较。
- 转化研究：通过检测方法的保守性适应，将体外干性表型与潜在的体内模型相连接。
- 企业级复用：该条件性基因敲低-类球体形成平台可跨干性相关基因及除胃癌外的多种癌症类型重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在原代来源细胞中进行可诱导且可逆的基因敲低，减少干细胞特性相关基因功能的机制模糊性。
- 操作价值：通过类球体形成实验标准化干细胞特性的评估，提高实验室间的可重复性及检测方法的可转移性。
- 战略价值：通过提供基因抑制与肿瘤形成潜能丧失之间的因果证据，增强靶点选择的可信度。
- 项目组合影响：基于在与患者相关的模型中进行的功能验证，实现对clusterin等靶点的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 需要具备慢病毒制备、细胞培养以及分子生物学技术（包括转染和筛选）方面的专业知识。
- 依赖于超低吸附培养板、自动细胞计数仪以及用于验证的蛋白质印迹（Western blotting）设备的可及性。
- 为实现稳定的基因敲低，各实验室需对多西环素诱导和嘌呤霉素筛选的时间进行标准化。
- 需要优化聚凝胺（polybrene）浓度和慢病毒滴度，以实现对原代胃癌干细胞的高效转导。
- 该方法受限于以成球能力作为干性读出指标，可能无法全面反映异质性培养体系中所有的干性表型。
