利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体 关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

利用目前可用的生物化学方法检测细胞表面相互作用仍面临技术挑战。本方案提供了一种基于全基因组规模细胞筛选的遗传学替代方法，用于鉴定细胞表面的受体-配体相互作用。与大多数现有方法不同，该方法不对受体的生物学特性作任何预设假设。

该方法为识别由多种细胞表面分子介导的相互作用提供了机会。细胞表面分子可直接与单克隆抗体等药物结合，因此，鉴定这些分子所介导的相互作用可能具有重要的治疗意义。

该方法普遍适用于对探索细胞信号传导和识别过程感兴趣的研究人员，可应用于多种生物学背景，包括神经和免疫相互作用以及宿主-病原体相互作用。本实验方案需要高通量细胞分选仪和下一代测序仪。在开始实验前，请确保这些设备可用。

首先在96孔板中对生物素化蛋白样品进行八倍系列稀释，确保每种稀释液的最终体积至少为200微升，并包含一个仅带标签的对照。通过从每个孔中取出100微升并转移至新的96孔板，制备样品的重复板。包含一个仅带标签的蛋白质对照，该对照将在所有结合实验中用作对照探针。

向其中一块板的孔中加入 100 微升浓度为 0.1 微克/毫升的链霉亲和素-PE，向另一块板的孔中加入 100 微升稀释缓冲液。在室温下孵育 20 分钟。同时，用稀释缓冲液封闭链霉亲和素编码板的孔，封闭 15 分钟。

洗涤平板后，确保其完全干燥。然后将两块平板中样品的总体积分别转移至链霉亲和素编码平板的各个孔中，在室温下孵育一小时。孵育结束后，用200微升洗涤缓冲液洗涤平板三次。

加入100微升小鼠抗大鼠Cd4d3+4 IgG，将酶标板再孵育1小时。重复洗涤步骤。加入100微升碱性磷酸酶标记的抗小鼠抗体，室温下放置1小时。

然后用洗涤缓冲液洗涤各孔三次，再用稀释缓冲液洗涤一次。在显色乙醇胺缓冲液中配制浓度为1毫克/毫升的对硝基磷酸苯酯溶液，并向每孔加入100微升。37℃孵育15分钟后，在405纳米波长下测定各孔的吸光度。

使用在平板上无信号的最低稀释度作为制备四聚体的合适稀释倍数。将链霉亲和素-PE与适当稀释的生物素化蛋白在室温下孵育30分钟。随后将偶联蛋白置于避光管中，在4°C保存，以备后续使用。

将处理组和对照组样品的锥形管在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将其中一支试管中的沉淀在-20 °C冷冻保存以备后续使用。将另一支试管中的沉淀用含有1% BSA的10 mL PBS重悬，并在96孔板中留出100 µL细胞作为阴性对照。

然后将预偶联的重组蛋白加入锥形管和96孔板中的细胞悬液中。在室温下，于4°C条件下，在旋转摇床上以温和旋转方式孵育至少一小时进行细胞染色。随后在200 × g离心5分钟使细胞沉淀，并弃去上清液。

洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 5 毫升 PBS 中。使用 30 微米细胞筛过滤，以去除细胞团块。随后使用流式细胞仪进行分析。

使用阴性对照样本设门，筛选出BFP阳性且PE阴性的细胞。然后分选样本，将50万至100万BFP阳性且PE阴性的细胞收集到1.5毫升离心管中。分选得率取决于细胞与蛋白的结合情况，但通常可收集到PE阴性样本中1%至5%的细胞。

现在将分选后的细胞在500 × g条件下离心5分钟，然后小心移除上清液。沉淀物可在-20摄氏度下保存长达六个月。使用Magic的计数功能将未分选和分选后群体的序列比对至参考文库，从而获得原始计数文件。

使用未分选对照样本的原始计数作为对照，分选样本的计数作为处理，运行 magic 的测试功能。打开生成的基因汇总文件，将暂停秩（pause rank）列按升序排列。然后筛选出错误发现率小于 0.05 的显著结果。

该受体通常排名较高，常位列第一。最后使用R或相应的软件绘制正向选择的稳健排名算法得分。分别在NCI-SNU-1和HEC-293细胞中进行了全基因组规模的基因敲降筛选，以鉴定人TNFSF9和恶性疟原虫或人TNFSF9和恶性疟原虫Rh5的结合伴侣。

Rh5的结合行为受到硫酸乙酰肝素及其已知受体BSG的影响，而TN-FRSF-9在与可溶性肝素预孵育后，对其已知受体TN-FSF-9的结合能力未受影响。对照突变文库中的GNA分布显示，该文库的复杂性在实验过程中得以维持。

通过比较靶向非必需基因参考集的gRNA所观察到的倍数变化分布与靶向必需基因参考集的分布，评估了筛选实验的技术质量。此外，通路水平的富集分析显示，在缺失基因群体中鉴定出预期的必需通路，并且这些通路显著富集。该分析基于对照样本与原始质粒文库的比较。

稳健排序算法（RRA评分）可用于评估哪些G-RNA的排序 consistently 高于预期。在针对TNFRSF9的筛选中，排名最高的基因为TNFSF9，其为已知的结合伴侣。此外，还鉴定出多个与TP53通路相关的基因。

对于RH5而言，除了已知的受体以及合成硫酸化糖胺聚糖（gags）所必需的基因外，还鉴定出了SLC16A1基因。这种筛选方法通常非常可靠，直接相互作用的受体基因在该群体富集基因列表中的排序应较高。对筛选获得的候选基因进行验证至关重要。

如果该相互作用由蛋白质介导，则可采用设计用于研究二元蛋白质-蛋白质相互作用的生化方法进行进一步的验证研究。由于该方法具有无偏倚的全基因组规模特性，我们预期其将有助于探索由难以研究的细胞分子（如脂质、多次跨膜蛋白和聚糖）所介导的相互作用。该方法还可能揭示受体转运和生物学功能所必需的新信号通路。