经验证的LC-MS/MS检测面板用于定量小份毛发样本中11种耐药结核病药物

患者的依从性往往难以保证，且药物代谢因人而异，因此在结核病治疗过程中，对药物浓度进行客观检测可能对预防耐药性的产生具有重要意义。若能更准确、便捷地量化患者的依从性，医疗人员便可制定出有效限制耐药性发展的治疗方案。我们已开发出首个可在单次检测中对少量毛发样本内多种结核病药物进行多组分分析的质谱检测 panel。

我们的多药物检测面板每位患者仅需一个两毫克的样本，且无需固相萃取或过滤步骤，以避免样本体积的任何损失。在治疗初期对药物暴露水平进行客观测量，可能帮助临床医生及时发现治疗方案中个别药物存在的问题。为准确测定药物浓度水平，毛发样本必须在分析当天进行研磨粉碎。

采集毛发样本时，在获得书面知情同意后，准备好以下材料：一张细标签、两张受试者标签、一把剪刀、一张展开的铝箔、一片酒精擦拭巾和一个塑料袋。用酒精擦拭巾将剪刀刀片擦拭干净。然后到头部后方，如有需要，可用发夹将上层头发撩起。

从头部后侧收集30根头发，并用手分离出一束。将剪刀贴近头皮，剪下这束头发。小心地将这束头发放在铝箔上。

将细小的标签贴在毛束的远端，并用胶带将其牢固地固定在铝箔上。远端是指距离头皮最远的一侧。将铝箔顶端部分向下折叠，覆盖住毛束，并在铝箔上方贴上受试者标签。

将折叠好的铝箔放入塑料袋中，并在塑料袋上方贴上另一张受试者标签。从头发样本中提取药物时，将每份头发样本各称取两毫克，分别放入已标记的珠磨管中，同时将空白头发样本各称取两毫克，分别放入另外16根珠磨管中。称量完成后，将所有珠磨管放入珠磨匀浆机中，以每秒6.95米的速度匀浆，运行两个30秒的循环，每个循环之间休息15秒。

第二次均质化后，向每个样品中加入500微升适当浓度的内标混合液，并向基质空白管中加入500微升甲醇。根据表格，向校准曲线管中加入相应体积的参考标准品混合液，然后将所有管子置于37摄氏度水浴中，轻轻振荡孵育两小时。孵育结束后，将每根珠管中的上清液转移至新的已标记微量离心管中，并向珠管中加入500微升甲醇。

涡旋混合珠管，并将甲醇洗涤液转移至相应的微量离心管中。离心样品，小心地将上清液转移至新的离心管中，避免扰动毛发沉淀物。在32摄氏度下将管中液体完全蒸发至干燥，然后用200微升含1%甲酸的高效液相色谱级水重新溶解样品。

涡旋后，将液体样品转移至带有250 µL插管的棕色样品瓶中。进行液相色谱-串联质谱分析时，首先将一根2–100 mm、粒径2.5 µm、孔径100 Å、完全由多孔二氧化硅制成的极性封端醚键连接苯酚微球色谱柱安装到色谱柱舱中。确认该色谱柱还安装有制造商推荐的保护柱芯。

将 MDR-TB LCMS 方法转换信息（包含在 transitions.csv 文件中）复制并粘贴到质谱窗口的文本框中。在电子表格中，创建一个批处理序列，依次为：标准曲线、质控样品、患者样本、标准曲线、质控样品、患者样本、标准曲线和质控样品。

在运行开始和结束时，以及校准曲线、质控样本和患者样本前后均加入溶剂空白进样。然后在校准曲线和高浓度质控样品瓶的进样序列中至少插入八个溶剂空白进样，以减少分析物的残留。当批处理完成后，打开定量分析软件。

滚动查看各组分的过渡状态，确保自动选择的保留时间准确，并检查高斯平滑是否已设置为 1.5。接下来，单击以显示校准曲线和回归结果，并将权重类型设置为“1/x”。单击“确定”，并验证校准曲线和质控样品，以确保该批次运行成功。

对于每种定量参考分析物，至少有三分之二的校准点其准确度必须在80%-120%范围内。检查校准曲线图上方显示的R值是否大于0.975。若上述所有条件均满足，则该批次通过验证，样品可进行定量。点击工具栏中的“编辑”，然后点击“复制整个表格”。

然后将表格粘贴到电子表格中，并使用两次样品进样所计算浓度的平均值来确定每份样品的报告浓度。此处展示了一张色谱图，其中包含了所有检测的11种耐药结核病药物的确认水平。在这些图中，可以观察到其中一个校准品中某种特定药物的提取离子色谱图。

通过定量离子和定性离子的过渡来定性确认药物的存在，因为定量离子峰面积与定性离子峰面积之比在不同样品间保持恒定。同时监测内标物，以确保每次样品进样的归一化。在本项分析中，从南非西开普省在直接观察治疗条件下服用耐药结核病药物的96例患者中，选取了15份头发样品作为代表性样本，用于测定各分析物在最低和最高浓度范围内的典型药物水平。

在没有固相萃取或过滤步骤的情况下，将上清液转移至蒸发管时需格外小心。任何被转移至管中的物质最终都可能被注入色谱柱。由于珠子捕获仪的转子若未拧紧或锁定可能会飞出，请在操作前务必仔细检查转子。

与HIV领域中的抗逆转录病毒药物不同，结核病药物的药代动力学、依从性与临床结局之间的关系在很大程度上尚未得到充分研究。我们假设某些结核病药物在毛发中蓄积不佳，针对这些药物的代谢产物进行检测可能有助于更好地了解患者的依从性。