利用液相色谱-质谱法同时定量分析癌细胞培养液中选定的犬尿氨酸类物质

犬尿氨酸类物质与多种疾病（包括癌症）中的免疫反应调控有关。可靠且经过验证的多种犬尿氨酸检测方法有助于开发更有效的治疗方案。本方案采用液相色谱串联质谱法，鉴定癌细胞培养液中收集的培养基内由犬尿氨酸代谢途径产生的不同色氨酸代谢物。

初学者在样品制备或数据采集与解读步骤中可能会遇到一些困难。通过遵循本实验方案及建议，可避免错误并获得可靠的数据。配制试剂母液时，使用精度最高的天平称取每种试剂各 0.3 毫克，分别溶于 300 微升相应的溶剂中，以获得浓度为 1 克/升的各试剂母液。

制备活性炭处理的培养基时，称取280毫克活性炭放入锥形管中，加入5毫升为培养目标细胞而配制的液体培养基。将含有培养基和活性炭的试管置于摇摆摇床中，在室温下以每分钟50次振荡频率振荡2小时。孵育结束后，通过离心沉淀活性炭，并小心收集上清液，避免扰动活性炭沉淀，然后使用0.45微米注射器滤器过滤培养基。

配制校准溶液时，向经活性炭处理的培养基中加入 0.75 微升浓度为 0.1 克/升的 3NT 溶液，并将 3-H 犬尿氨酸、3-HAA 犬尿氨酸和黄尿酸分别添加至至少六种不同浓度，以覆盖所有校准范围，每份样品最终体积为 150 微升。涡旋混匀后，向每支试管中加入 150 微升 −20 摄氏度的甲醇（含 1% 甲酸），用于样品去蛋白，盖紧管盖后再次涡旋混匀。在 −20 摄氏度孵育 40 分钟后，离心样品，并使用自动移液器将每份上清液中的 270 微升转移至各自的平底玻璃小瓶中。

将小瓶放入蒸发仪中，使用适用于水-甲醇组分的适当程序，轻柔蒸发挥发性成分约30分钟。当试管干燥后，每份样品重新溶解于60 µL含0.1%甲酸的水中，涡旋混匀样品，然后将每种溶液转移至各自的1.5 mL离心管中进行离心。在不扰动沉淀物的情况下，将上清液转移至带有锥形玻璃插件的色谱小瓶中，并将小瓶放入液相色谱-质谱（LC-MS）自动进样器中。

在运行样品之前，使用流动相冲洗液相色谱系统，以去除气泡并充分润洗所有溶剂通道。接着，先用100%乙腈冲洗保护柱和分析柱约30分钟，再用100%溶剂A冲洗系统，直至柱压稳定。然后在数据采集软件中设置适当的液相色谱参数，并建立样品在液相色谱系统上的运行列表。为构建校准曲线，在数据采集软件中将校准标准品加入运行列表，每种标准品重复进样三次，随后在保留时间分别约为4.4、10、16、21和30分钟处，对3-羟基犬尿氨酸、犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、3-硝基酪氨酸和黄尿酸的色谱峰进行积分并测量峰面积。

为了从体外细胞培养物中收集上清液样品，在目标细胞进行48小时标准细胞培养后，将每个孔中的500微升上清液转移至各自的1.5毫升离心管中，通过离心去除细胞碎片，然后将培养基上清液转移至新的离心管中，在-80摄氏度下保存直至分析；同时将细胞沉淀在-20摄氏度下保存，直至进行蛋白定量分析。为进行LC-MS分析准备样品时，将每份解冻的培养基样品149.25微升转移至新的1.5毫升离心管中，并向每管加入0.75微升浓度为0.1克/升的3NT溶液。在按上述方法制备样品后，向每管加入150微升含有1%甲酸的-20摄氏度甲醇，按上述方法制备样品用于LC-MS分析。

当工作列表完成后，测定每种分析物的峰面积，并使用针对每种分析物建立的独立线性校准方程，计算各实验样品中分析物的浓度。为评估与培养基样品相对应的细胞蛋白含量，将每份细胞沉淀重悬于100 µL PBS中，于-20 °C冷冻1小时，随后在冰上解冻。反复冻融三次后，通过离心收集细胞裂解液，并将上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。

用新鲜的PBS将样品稀释10倍，并向96孔板的相应孔中加入适量体积的牛血清白蛋白标准溶液，每个样品设两个复孔。向96孔板的相应孔中加入10至15微升每种细胞裂解液样品的上清液，并向标准品孔和样品孔均加液至每孔终体积为50微升PBS。随后，向每孔加入200微升用超纯水稀释5倍的Bradford试剂，于室温孵育至少5分钟。

孵育结束后，将酶标板放入酶标仪中，在595纳米波长下测定吸光度，随后绘制标准曲线，用于计算各样本中的蛋白含量，并将每个样本的犬尿氨酸浓度除以总蛋白含量，以标准化每微克蛋白所对应的犬尿氨酸含量。以下是分析含有4.5克/升D-葡萄糖和10%胎牛血清的培养基时获得的单四极杆质谱结果。注意样本中显示犬尿氨酸存在的小峰。

在采集实际样品数据之前，应先运行质控样品，以确认分析物的保留时间是否合适，因为可能会观察到液相色谱信号的偏移或不匹配情况。共洗脱的基质成分可能产生与目标分析物所选母离子质荷比相同的离子。例如，在本分析中，未知化合物的峰出现在监测质荷比为206的离子的扫描周期内。

由于保留时间不匹配，该信号并不对应于目标分析物。尽管色氨酸同位素与母离子具有相同的质荷比（206），但色谱分析显示，色氨酸信号与黄尿酸信号明显分离，表明在测试的癌细胞培养基中色氨酸的含量并未影响黄尿酸的定量。对两种不同类型癌细胞系培养基的分析表明，所评估的人类上皮性乳腺癌细胞释放的色氨酸代谢物含量不同，而所测试的人类卵巢癌细胞则产生了显著更高水平的犬尿氨酸。

在样品制备过程中使用内标有助于获得可靠的数据。将数据归一化至蛋白含量可校正各孔之间细胞数量的差异。我们的方案可进一步扩展以检测其他分析物，但在不同实验条件下，这些分析物可能在培养基中积累。