高通量测定个体酒精镇静时间的方法 黑腹果蝇

果蝇是研究酒精敏感性遗传基础的优良模型，因为可以在受控的遗传背景和环境条件下精确量化酒精敏感性。目前测量果蝇酒精敏感性的方法通常针对果蝇群体进行检测。本文介绍一种简单、低成本、高通量的方法，可用于评估大量单只果蝇的酒精敏感性。

果蝇对酒精敏感性的差异可转化为人类中类似的表型，因为果蝇约有75%的基因与人类直系同源基因相同。我们开发的检测方法也可用于测量挥发性物质对其他昆虫（包括其他蝇类或疾病传播媒介）的急性毒性效应。首先，制作一个24孔细胞培养板的纸板模板。

沿培养板描出轮廓，并剪下指定区域。然后使用纸板模板制作一块与培养板大小相同的小型昆虫筛网。在24孔细胞培养板的边缘涂抹一圈热熔胶，将筛网粘附在孔的上方。

然后使用热熔胶枪将木制冰棒棍固定在培养皿的三个侧边。准备的培养皿数量以能够放入拍摄室为宜。要制作拍摄室，需在聚苯乙烯盒的一侧切割出一个与摄像机镜头大小相同的孔，并在另一侧切割出一个与照明垫大小相匹配的狭缝。

将照明垫插入狭缝中，并将相机放置在照明垫上方的镜头孔内。将所有测试材料置于受控环境中，理想情况下应为行为学实验箱，环境条件为相对湿度约30%、温度25摄氏度、气流均匀、噪声水平低于65分贝。使用先前制作的纸板模板裁剪两块纱布。

然后用移液器将1毫升100%乙醇通过筛网转移至每个孔中。干燥筛网，并将两层纱布放在其上方。使用纸板模板作为参考，在短边一侧扩大1至2厘米，裁剪一块小的柔软塑料切菜板。

切割后，确保塑料片仍能插入测试装置的三根木制压舌板之间，但一端悬空。按照文稿说明准备好吸液器，并用其将每只果蝇转移至24孔细胞培养板中的各个孔内，将已吸取果蝇的孔用柔性塑料片盖住。记录每只果蝇所在的孔位及其相关的基因型或表型信息。

将柔软的塑料片与装有果蝇的细胞培养板顶部对齐，然后将该培养板倒置在装有乙醇的改良细胞培养板上。使用冰棒棍调整倒置的细胞培养板的位置，确保每个含有乙醇的孔与每个含有果蝇的孔准确对齐。确认照明垫已调至最大亮度，并开始用摄像机进行录制。

通过小心移除两块培养板之间的塑料隔层，使果蝇暴露于乙醇环境中，注意不要碰松纱布。当怀疑所有果蝇均已失去姿势控制能力时，用力轻敲培养板中心。若观察到有活动，则继续记录，并每隔一到两分钟轻敲一次，直至无任何活动为止。

当果蝇无任何活动时，终止记录。为回收果蝇，取下测试装置的顶板，用移液器将单只果蝇吸入选定的容器中。每小时至少更换一次改良细胞培养板中的乙醇，以在整个实验过程中维持稳定的乙醇暴露浓度，并根据需要重复实验多次。

观看录像以确定果蝇的麻醉时间，该时间定义为果蝇失去姿势控制和运动能力的时刻。为确保准确性，应倒放录像，并记录果蝇开始移动的时间点。该方法可在10分钟内对大量果蝇生成数据。

使用两块24孔板同时测量两种对酒精敏感性不同的DGRP品系共48只果蝇的乙醇镇静时间。较大的样本量可提高准确性，并减少环境变异带来的误差。RAL_555果蝇的敏感性低于RAL-177果蝇。

RAL_177品系的雄性和雌性未表现出性二型效应，而RAL_555品系的雌性对乙醇暴露的敏感性低于雄性。在实施本方案时，必须精确完成果蝇的吸取和细胞培养板的翻转操作，以获得理想结果。由于该方法能够对单只果蝇进行评估，避免了群体相互作用带来的混杂效应，因此该检测方法提高了果蝇模型在酒精暴露急性效应高通量研究中的应用价值。