微区设计及用于¹⁵氮分析的植物与土壤样品制备

该方法可帮助研究人员量化肥料驱动的氮素对土壤-作物系统的影响，并解答有关氮素利用效率的问题。该技术的主要优势在于，可在连续两个生长季内进行多次土壤和植株取样。该方法有助于我们更深入地理解氮素循环中的矿化和迁移过程，从而改进氮肥管理指南。

建立田间试验小区时，种植六行玉米，行距为76厘米，最终小区尺寸为15.2米×4.6米。在小区纵向两端各设置1.5米的边行保护区，并在取样区和收获区相邻处额外设置一个1.5米长的边行保护区。将第二行和第三行指定为生长季期间植株和土壤取样区，第四行和第五行为玉米籽粒产量的收获区。

建立一个以宽度方向为中心、面积为2.4米×3.8米的微型样地，用于收集所有富集氮的植物和土壤样品，在长度和宽度方向上均保留38米的未采样边界，以尽量减少边缘效应。然后使用不同颜色的标志旗标定处理样地和微型样地的四个角。进入微型样地时需穿戴鞋套，并尽量减少在微型样地内的走动，以防止未富集区域受到污染，离开微型样地时应脱下鞋套。

施用氮-15标记肥料时，将10原子百分比的氮-15标记尿素与普通尿素混合稀释至5原子百分比的氮-15标记尿素，并将尿素溶解于2升去离子水中，以确保尿素肥料的均匀标记。使用经校准的背负式二氧化碳喷雾器，将氮-15标记尿素溶液均匀喷施于微型小区。施肥后24小时内，通过轻度耕作、手工耙地或喷灌64厘米的水量，将含尿素的肥料混入土壤，以尽量减少挥发损失的风险。

在每个采样阶段，从采样区域内采集6株地上部分未富集氮-15的玉米植株混合样品，以及从氮-15富集微区中采集6株地上部分玉米植株混合样品。将VH期和R1期的地上生物量切碎，并将切碎后的生物量放入标记好的袋子中，置于60摄氏度的强制通风烘箱中烘干至恒重。记录生物量的干重，并将100至200克干燥植株材料充分混合后研磨，直至能通过2毫米筛孔。

然后充分混合研磨后的材料，并将子样品存入贴有标签的硬币信封中以供进一步处理。对于土壤样品的处理，在施肥后八天内，使用手动取样器从VH和R1区域的未施肥采样区采集四个直径为1.8厘米的土芯，组成混合土壤样品，且采样时间应与植株采样同步；同时使用另一个单独的手动取样器从微区试验 plot 采集15个直径为1.8厘米的土芯，组成混合土壤样品。将每个混合土壤样品在桶中均质化，然后放入预先贴好标签的纸袋中。

然后将土壤样品置于35 °C的强制通风烘箱中干燥至恒重，再将每个样品研磨至可通过2毫米筛网。在实验室进行样品处理时，先将研磨后的植物样品于60 °C烘箱中干燥过夜，然后分别将干燥后的植物和土壤样品放入滚磨罐中，在4 ×g条件下滚磨6至24小时，直至样品达到细粉状的一致质地。随后将充分研磨后的材料转移至洁净并贴好标签的20 mL硅烷化小瓶中。

为了测定每个样品中的总氮和氮-15浓度，佩戴腈手套后，首先使用实验室擦拭纸和乙醇清洁微量天平、工作台面、药匙和镊子。将清洁后的工具放置在实验台上的擦拭纸上，并用镊子轻轻撑开样品胶囊的开口。将改装后的胶囊置于微量天平称量盘上方一到两毫米处，撕开胶囊，使其内容物落入天平上。

使用镊子将胶囊放回洁净的工作台面，用刮勺小心地向胶囊中加入所需质量的精细研磨样品材料。用镊子缓慢地夹紧已装样胶囊顶部的三分之一，然后折叠封口。继续折叠并压紧胶囊，注意不要刺破或撕裂锡箔，直至形成球形。

使用镊子将包裹好的胶囊从一厘米高度多次掉落至干净的深色表面，以检查是否泄漏。若无粉末出现，则按前述方法称量样品，并将胶囊放入96孔板的一个孔中，记录孔位。每次样品封装之间，需用乙醇和实验室擦拭纸清洁所有工具和表面，特别注意刮刀和镊子的边缘。

在此代表性分析中，地上玉米生物量样品中来自肥料的氮浓度在生长季早期最高，随后在每个连续取样时期逐渐降低。然而，来自土壤的氮始终是地上生物量氮的主要组成部分，表明土壤氮供应对玉米最佳生长的重要性。在第一年的生理成熟期，地上生物量氮中约有27%来自肥料，籽粒、秸秆和穗轴各组分中也观察到相似的比例。

在第二年的生理成熟期，地上生物量中仅回收了第一年施用肥料所含氮素的2%。大约每公顷有1.6千克来自第一年肥料的氮素随籽粒被带走。施肥后八天内，大部分来自肥料的氮素如预期般集中在土壤剖面的前15厘米土层中。

然而，每公顷约有22千克的氮素已迁移至更深层土壤中，而4%至10%来自肥料的氮素则无法追溯。事实上，在第一年和第二年结束时，土壤-玉米体系内可追溯的肥料来源氮素不足50%，其余部分要么损失至环境中，要么淋溶至90厘米深的土壤采样层以下。在进行该操作时，应格外小心以避免交叉污染，否则可能导致结果无效。

可进一步分析土壤的无机和有机组分，以加深对氮循环动态的理解。通过植物不同部位分析植物样品，可用于阐明氮素吸收和随时间转运的过程。