利用益生菌无细胞上清液在结直肠癌细胞三维球体培养中评估细胞死亡

本方案经过优化，可更便捷地研究乳酸杆菌无细胞上清液对多种结肠癌细胞球体的抗癌作用。该技术是首个在模拟体内条件下探究乳酸杆菌无细胞上清液对结肠癌球体抗癌效应的方法。首先，将经高压灭菌的MRS琼脂平板置于37摄氏度、含20 ppm氧气的厌氧氢气培养箱中，并接种新鲜解冻的乳酸杆菌菌种。

向试管中加入2至3毫升MRS肉汤，并添加L-半胱氨酸，然后用丁基橡胶塞和试管盖密封试管。接下来，用接种环挑取单个菌落，将其放入含有500微升PBS的1.5毫升培养管中。将菌落在盐水中充分重悬，然后将整个细菌悬液转移至1毫升注射器中。

将针头插入培养管盖的中心，并将菌落接种到培养基中。将培养物置于摇床培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳及200转/分钟的条件下培养。两天后，使用分光光度计测定培养物在620 nm处的光密度（OD620）。

当OD620达到2时，通过离心沉淀细菌，并用PBS洗涤细菌沉淀。第二次离心后，将细菌重悬于4毫升RPMI 1640培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清且不含抗生素，然后将细菌置于摇床培养箱中，在100转/分钟条件下孵育4小时。孵育结束后，通过离心收集细菌沉淀，将上清液经0.22微米滤器无菌过滤，保存于-80摄氏度。

为进行类球体形成实验，将目标结直肠癌细胞系在细胞培养箱中以单层形式培养于100毫米的培养皿中。当细胞融合度达到70%至80%时，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，每次洗涤后加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。消化2分钟后，在光学显微镜下观察细胞是否已解离。

如果细胞已脱落，加入五毫升培养基以中和酶反应。将每份细胞培养物中的细胞收集至一个15毫升锥形管中，通过离心分离细胞，并每管加入三毫升培养基轻轻重悬细胞沉淀。随后，采用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。

计数后，用新鲜培养基将细胞稀释至每毫升含1×10⁵至2×10⁵个细胞，并向细胞中加入甲基纤维素，使其终浓度为0.6%。将细胞转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将200 µL细胞悬液分配至超低吸附96孔圆底微孔板的每个孔中。随后，将培养板置于细胞培养箱中孵育24至36小时，然后通过光学显微镜检查球形细胞团（spheroids）的形成情况。

对于LCFS处理，将制备好的解冻LCFS储备液用新鲜培养基连续稀释至25%、12.5%和6%的浓度，并使用200微升移液器小心吸出每孔贴壁培养的结直肠癌细胞系中尽可能多的上清液。随后，轻柔地向每组癌细胞中加入200微升含有LCFS的培养基，每个浓度设三个重复，然后将培养板放回培养箱继续培养24至48小时。0.6%的甲基纤维素浓度可使被测癌细胞系形成致密的球状体，表明使用本方案可从多种类型的结直肠癌细胞中生成球状体。

使用25% LCFS培养的类球体表现出表面结构紊乱，并以剂量依赖性方式降低细胞活力。事实上，与存活的对照细胞相比，LCFS共培养细胞表现出更高水平的碘化丙啶表达。还可通过逆转录PCR分析、蛋白质印迹以及流式细胞术Annexin V/7-AAD分析，评估LCFS对癌细胞凋亡的影响。

在更换培养基时务必轻柔操作类球体，因为类球体容易破碎，从而无法观察LCFS处理的效应。完成此步骤后，可进行细胞活力检测、定量实时PCR、蛋白质印迹和FACS分析，以更详细地表征LCFS的抗癌作用。