内嗅皮层-海马器官型脑片培养中的癫痫发生模型

癫痫是一种常见的神经系统疾病。鼻周皮层-海马组织切片可表现出逐渐发展的类似癫痫样事件，与体内癫痫相似，因此可作为癫痫发生的离体模型。该系统确实是监测癫痫发生动态变化及进展过程的优良工具，也可用于筛选该脑部疾病的潜在治疗靶点。

与我一同演示操作步骤的是我的学生 Francisco Meda 和 Mafalda Carvalho。要从出生后第6至7天的 Sprague-Dawley 幼鼠中取出脑组织，首先用5毫升 GBSS 将头部清洗三次。在生物安全柜中操作，用尖头镊子牢固地插入眼眶以固定头部，然后用细头剪刀沿中线从枕骨大孔至额叶方向剪开头皮。

以相同方式沿大脑横裂切开颅骨，使用弯曲的长镊子将颅骨碎片分开。用刮铲去除嗅球，并将脑组织背侧朝上转移至含有5毫升冷GBSS的60毫米培养皿中。将精细镊子插入小脑，同时沿中线插入刮铲，小心地分开脑半球。

使用短弯镊子小心去除覆盖海马体的多余组织，避免触碰海马体结构，然后在每个海马体下方进行切割。将一侧半脑的海马体朝上、彼此平行地逐个转移至一片滤纸上。将滤纸置于组织切片机上，使半脑与刀片垂直，将半脑切成350微米厚的切片。

将切好的组织转移至一个新的含有5毫升冷GBSS的培养皿中，使用圆头电极小心分离组织切片，仅保留海马和鼻周皮层结构完整的样本。齿状回（DG）和CA区域，以及内嗅皮层和外鼻周皮层区域均应清晰可辨。使用刮勺和圆头电极将最多四个完整切片分别放置于六孔板中相应数量的孔内插入物上，每孔含有1.1毫升培养基。

使用 P20 移液器吸除每个切片周围多余的解剖液。将培养板放入细胞培养箱中。每两到三天更换一次培养基。

使用镊子提起小室，吸出对应孔中的培养基，然后将小室放回原位。使用 P1000 移液器向每个孔中加入一毫升新鲜的 37°C 培养基。

在闭合回路中准备电生理实验装置。确认界面式记录室的流速设定为每分钟2毫升，并打开碳酸盐气体阀门。检查系统中的水位，并在界面记录室中放入一片滤纸以吸除多余的培养基。

在切片下方放置一张镜头清洁纸以提供灌注液，并打开温度控制器、放大器和显微操作器。使用注射器将新配制的人工脑脊液装入玻璃电极中。将玻璃电极插入接收电极内，并等待界面室内的温度稳定在 37 摄氏度。

在生物安全柜中操作，将插入物置于含一滴培养基的60毫米培养皿中。使用锋利的刀片从插入物上切下一薄片，并将该切片放入界面式记录室中，使海马体朝向右下角，随后将记录电极插入CA3锥体细胞层，启动连续采集程序，记录切片30分钟。进行碘化丙啶摄取实验时，需在生物安全柜中操作。

将插入物从孔中取出，向培养基中加入碘化丙啶，使每孔终浓度为2 µM。在将插入物放回孔中之前，缓慢振荡培养板，并注意确保切片下方无气泡。当所有切片处理完毕后，将培养板放回细胞培养箱中。

进行切片免疫染色时，在碘化丙啶孵育结束后，吸去每个孔底部的培养基，从插入式培养小室的顶部和底部各加入1毫升4%多聚甲醛。室温下固定1小时后，用PBS洗涤切片两次，每次10分钟，每次使用1毫升PBS。用疏水性记号笔在载玻片上画出两个矩形区域。使用锋利刀片将切片从插入式小室上切下，并将每一片切片分别放入一个矩形区域内。

在每一片组织切片上加入通透封闭液，在室温下孵育三小时。孵育结束后，向每一片切片中加入目标一抗，在4摄氏度下孵育过夜。次日早晨，用PBS-Tween洗涤切片三次，每次10分钟，随后在室温下用相应的二抗孵育切片四小时。

随后，按照演示方法洗涤切片，并向每张切片加入 50 µL Hoechst 溶液，在室温下孵育 20 分钟。Hoechst 孵育结束后，再次洗涤切片，向每张切片加入 50 µL 封片介质，盖上盖玻片，并用指甲油封边。将载玻片在室温下干燥 24 小时后，通过共聚焦显微镜观察免疫荧光染色和碘化丙啶摄取情况。

体外培养7天时，鼻周皮层-海马器官型脑片表现出混合性的痫样间歇期和痫样发作活动。体外培养14天时，自发活动以痫样放电为特征，并在体外培养21天时发展为占主导地位的痫样活动，痫样事件持续时间超过一分钟。碘化丙啶摄取实验及针对神经元标记物NeuN的免疫组织化学染色显示，体外培养7天的脑片中已出现一定程度的神经元死亡，而在体外培养14天时，海马各区域的神经元死亡显著增加。

体外培养7天时，具有低CD68表达的分支状小胶质细胞多于Iba1阳性且CD68阳性的活化小胶质细胞。而在体外培养14天时，在海马区所有区域，Iba1阳性且CD68阳性的阿米巴样M1型小胶质细胞数量均超过低CD68表达的小胶质细胞。在体外培养14天时，可观察到部分呈现高度分支形态的Iba1阳性且CD68阳性细胞，提示可能存在M2型抗炎性小胶质细胞表型。

体外培养 7 天时，CD3 的表达几乎无法检测到；而在体外培养 14 天的脑片中，可观察到肥大的胶质纤维酸性蛋白阳性且 CD3 阳性的星形胶质细胞，提示 A1 型星形胶质细胞呈进行性激活。制备鼻周皮层-海马脑片时需格外小心。务必去除海马上方的多余组织，因其可能在切片过程中破坏脑片的完整性。

结构缺陷将对脑片的存活能力产生负面影响。除了上述已展示的方法外，还可在此系统中应用多种检测手段，如蛋白质印迹分析、实时PCR和ELISA，以探讨关于癫痫发生的特定问题。