利用胸苷类似物BrdU分析大鼠细胞增殖与神经发生的免疫组织化学技术
2020年9月9日
本文介绍了四种最常用的可视化BrdU阳性细胞的技术，用于检测大鼠中的成年神经发生。本研究包括试剂制备、胸苷类似物给药、经心脏灌注、组织制备、过氧化物酶免疫组织化学反应、免疫荧光、信号放大、复染、显微镜成像以及细胞分析的操作说明。
这是成体神经发生领域的一项关键实验方案。本文详细描述了实现成功染色所需的各个步骤。该技术能够在保持组织完整性的前提下，同时鉴定处于分裂状态的细胞中共同表达的特定蛋白质。
我们建议预先测试组织抗体及实验条件。关键步骤包括膜通透化、谨慎的DNA变性，以及优化封闭和洗涤步骤的时间。对于新建立的实验室而言，该技术的标准化具有挑战性。
在啮齿类动物中，胸苷类似物的试剂配制与给药对于实验成功至关重要。进行胸苷类似物BrdU给药时，固定实验大鼠的下腹部以限制其活动，使用带有23号针头的1毫升注射器，将新配制的50毫克/千克BrdU溶液经腹腔注射入动物体内。在适当的实验终点，取出脑组织并将其冷冻，以便使用冷冻切片机获取40 µm厚的冠状切片，并按采集顺序将切片放入24孔细胞培养板的各个孔中，每孔加入冷冻保护液。当所有切片收集完毕后，将样品置于-20 °C保存，可保存数月之久。
为了评估BrdU染色，使用过氧化物酶反应及亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，将切片从冷冻保护液转移至0.1摩尔PBS中，直至样品达到室温，随后用新鲜的0.1摩尔PBS洗涤组织三次，每次10分钟。最后一次洗涤后，在室温下将切片置于内源性过氧化物酶阻断液中孵育30分钟，接着用0.1摩尔PBS洗涤三次，每次10分钟。最后一次洗涤后，将切片在37摄氏度下用2摩尔盐酸孵育20分钟，随后用0.1摩尔硼酸缓冲液冲洗一次，每次10分钟。
在冰冻的0.1摩尔PBS中清洗三次后，将样品在PBS+封闭液中于室温孵育两小时，随后在4摄氏度下用小鼠抗BrdU一抗抗体在PBS+中过夜孵育。经过三次0.1摩尔PBS清洗后，将样品在室温下用适当的小鼠生物素化二抗抗体在PBS+中孵育两至四小时。清洗后，于室温下用ABC溶液处理切片一小时，随后进行三次0.1摩尔PBS清洗。
最后一次洗涤后，将切片转移至DAB-过氧化物酶底物溶液中，孵育2至10分钟，直至切片变为深灰色。若能观察到阳性细胞，用自来水冲洗三次，每次15分钟，随后用0.1摩尔PBS缓冲液洗涤三次。最后一次洗涤后，用软毛刷小心地将切片贴附于明胶包被的载玻片上，在室温下空气干燥过夜。
第二天早晨，使用永久封片剂将盖玻片覆盖在样品上。为了定量BrdU阳性细胞，首先在显微镜下使用4倍物镜识别齿状回，并沿Z轴仔细搜索颗粒细胞层中被BrdU标记的细胞核。在选定整个齿状回区域的间隔切片进行细胞搜索后，计数所有BrdU阳性细胞。
标记细胞核的形态可能因细胞掺入的BrdU量不同而发生变化。在Z轴上缓慢移动，对每只动物至少10个切片、每组至少五只动物中整合成簇的全部细胞核进行定量分析。进行图像去卷积时，打开衍射点扩散函数3D插件，填写所有必需的数据，点击“确定”并保存文件。
接下来，打开 DeconvolutionLab2 插件，将匹配的 Z 轴层叠图像和点扩散函数（PSF）文件拖入对应的窗口槽中。选择反卷积算法及迭代次数，然后点击运行。要将反卷积后的图像合并为单一的 Z 轴层叠图像，请选择图像和堆栈，然后点击 Z 投影。
从投影类型菜单中选择“最大强度”。点击“确定”并保存文件。要创建 RGB 图像，请选择“图像”和“颜色”，然后点击“合并通道”，在下拉菜单中将相应的图像设置到所需的彩色通道。
然后取消勾选“创建复合图像”选项，点击“确定”并保存文件。当所有通道图像生成后，打开至少两个图像文件，并为每个图像文件选择不同的颜色通道，以创建RGB图像。
在这些图像中，可以观察到具有 BrdU 标记细胞的典型齿状回切片。从这些切片的放大图像中可见，标记细胞呈现出明显的深色染色。值得注意的是，未进行体力活动的对照组大鼠与接受体力活动的实验组大鼠之间，BrdU 阳性细胞数量存在显著差异，这一结果与其他已报道的研究一致，表明体力活动可增加成年个体齿状回中的细胞增殖。
进行该方案时，应使用新鲜配制的溶液，并轻柔操作组织。海马体在处理过程中容易与其余切片分离，可能导致遗漏。该方法可适用于DNA标记和索引评估、DNA合成以及双染细胞增殖研究。
我们希望这项工作对科学界有所帮助，并使得在免疫组织化学技术研究细胞增殖时，更容易回答新的科学问题。
概述
本研究聚焦于可视化BrdU阳性细胞的技术，以测量大鼠中的成年神经发生。本文详细描述了试剂制备、胸腺嘧啶类似物给药、组织处理以及显微镜成像的实验方案，用于评估齿状回中的细胞增殖。
关键研究组成部分
研究领域
- 成年神经发生
- 细胞增殖
- 免疫组织化学
背景
- 对分裂细胞进行半合子标记对于理解神经发生过程至关重要。
- 体力活动会影响齿状回中BrdU阳性细胞的数量。
- 染色技术的标准化对新建立的实验室构成了挑战。
使用的方法
- 腹腔注射BrdU用于细胞标记
- 标准免疫组织化学实验流程
- 显微镜成像分析与定量
主要结果
- 该方案可有效鉴定脑组织中 BrdU 阳性细胞。
- 对照组与实验组之间的细胞增殖存在显著差异。
- 所述方法可适用于多种细胞研究。
结论
- 该研究为评估成体神经发生提供了一种可靠的方法。
- 结果强调了体育活动在促进神经发生中的重要性。
常见问题
行业重要性概述
对细胞增殖和神经发生的准确定量在中枢神经系统药物发现中的靶点验证至关重要，因为机制性风险评估依赖于可重复的再生能力生物标志物。标准化的 BrdU 免疫组织化学技术通过提供基于组织学的定量读数，增强了临床前模型的预测可信度，从而支持早期发现阶段的“推进/终止”决策。该技术通过将功能性的靶点结合与海马神经发生的可测量变化相关联，解决了项目筛选中的一个关键转折点。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够在与疾病相关的体系中，探究与神经发生通路相关的治疗假设，并实现功能靶点的有效性验证。
- 操作价值：通过直接观察分裂中的细胞，支持生物学风险的降低，减少靶点结合研究中机制解释的不确定性。
- 预测价值：生成关于前体细胞活性的定量数据，为项目组合的优先排序以及先导化合物的发现策略提供依据。
筛选与检测方法开发
- 检测就绪性：生成标准化、可重复的组织切片，适用于高内涵成像和自动细胞计数工作流程。
- 定量输出：提供可量化的BrdU阳性细胞计数，支持在增殖通路中进行剂量-反应分析和化合物筛选。
- 平台复用性：建立可转移的组织学平台，适用于多种啮齿类动物模型，实现一致的目标验证研究。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：将啮齿类动物齿状回中的机制性发现与人类神经发生通路相联系，后者与认知和情绪障碍相关。
- 转化连续性：通过保守的增殖生物标志物，连接发现阶段的靶点调控与临床前疗效评估。
- 风险调整式推进：通过关联靶点介导的神经发生改变与行为模型中的功能结果，为推进或终止决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法可融入从靶点假设验证到先导化合物优化的整个发现流程，通过基于组织学的验证，在对先导候选化合物进行大量投入之前，支持其作用机制的风险评估。
- 发现生物学：通过在增殖微环境中实现BrdU与细胞类型特异性标志物的共检测，促进信号通路解析和靶点验证。
- 筛选：提供可重复的定量免疫组织化学结果，支持在不同筛选项目间进行检测方法的标准化。
- 分析：生成标准化的细胞计数和形态测量数据，实现对实验条件和处理效应的统计学比较。
- 转化研究：通过建立从啮齿类到人类神经病理生理过程可转化的保守神经发生读数，支持生物标志物的对齐与验证。
- 企业级复用：作为可重复使用的组织学平台，可在不同研究地点和项目中实现标准化，确保靶点验证的一致性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接定量测量神经发生区域的细胞增殖，为目标验证提供可预测的置信度。
- 操作价值：通过详细的组织处理、抗原修复和检测步骤，确保实验的可重复性和标准化。
- 战略价值：通过在早期降低神经发生靶点的风险，减少后期阶段的失败率，从而提高资本使用效率。
- 项目组合影响：通过将靶点调控与海马神经发生的可测量变化相关联，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 成功的组织处理和抗原检测需要具备组织学、免疫组织化学和显微镜技术方面的专业知识。
- 依赖于冷冻切片机、荧光显微镜和图像分析软件的可靠获取，以进行切片和定量分析。
- 为确保不同操作者之间的可重复性，必须采用标准化的抗体验证、封闭条件和DNA变性操作流程。
- 当应用于不同组织类型或固定方法时，需要调整孵育时间和抗原修复步骤。
- 由于组织在切片和封片过程中易碎，需谨慎操作以保持海马结构的完整性，从而限制了该方法的应用。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Thymidine Analog (5‐Bromo‐2'‐Deoxyuridine) BrdU Administration and Tissue Preparation
2:02
BrdU Detection
4:40
Cell Quantification
5:33
Image Deconvolution
6:59
Results: BrdU‐Labeled Cell Identification and Quantification in Representative DG Tissue Section
7:46
Conclusion
