利用计算机图像分析技术改进4T1乳腺癌模型中肺转移灶定量分析

本方案通过临床前乳腺癌模型，以更高的精确度和效率定量肺转移灶，肺转移是导致乳腺癌相关死亡的侵袭性且常见原因。与原始技术相比，本方案使研究人员能够更快地获得更一致的结果，并通过易于使用的计算机技术减少人工计数误差。

该技术可完全拓展应用于临床前研究，以评估乳腺癌治疗对肺转移的影响，使研究人员能够在成功治疗后证明转移负荷的减少。首先，标记一个15毫升的锥形管用于组织样本。然后向管中加入2.5毫升IV型胶原酶混合液和30单位的弹性蛋白酶。

将肺组织转移至一个干净的1X HBSS孔中，用镊子搅动以去除残留血液，然后将其转移至一个空的3.5厘米组织培养皿中。用剪刀将肺组织剪碎，再用2.5毫升HBSS冲洗培养皿，并将含有肺组织碎片的HBSS转移至预先准备好的含有胶原酶和弹性蛋白酶混合液的15毫升锥形管中。将锥形管置于摇床或旋转轮上，在4°C条件下孵育75分钟。

同时，为每只小鼠标记一个50毫升离心管和一个10厘米组织培养皿。如果需要进行稀释，应标记足够数量的组织培养皿用于不同稀释梯度。用1×HBSS将离心管中的液体体积补至10毫升，然后将内容物倒入置于50毫升锥形管上的70微米细胞滤筛中。

使用1毫升注射器的推杆通过滤筛轻轻研磨样品。将离心管以350 × g离心5分钟，弃去上清液，然后用10毫升1× HBSS洗涤沉淀物两次。将沉淀物重悬于10毫升60 µM 6-巯基鸟嘌呤完全培养基中，并根据需要采用梯度稀释法将样品接种至10厘米细胞培养皿中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育五天。将培养基从培养板中倾倒至适当的废液容器中。固定细胞时，向每块培养板加入5毫升未稀释的甲醇，室温孵育五分钟，并确保轻柔摇晃甲醇，使其覆盖整个培养板表面。

将甲醇从培养板倒入适当的废液容器中，然后用 5 毫升蒸馏水冲洗每块培养板。每块培养板加入 5 毫升 0.03% 亚甲蓝溶液，在室温下孵育 5 分钟，确保轻柔摇动亚甲蓝溶液使其覆盖整个培养板表面。将亚甲蓝溶液倒入适当的废液容器中，再用 5 毫升蒸馏水冲洗每块培养板一次。

将培养皿倒置，轻压在纸巾上以吸去多余液体。将培养皿放在其皿盖上，室温晾干过夜。转移性克隆将呈现蓝色。

平板干燥后，可于室温下长期保存。从平板上取下带标签的盖子时，需注意确保样品的清晰标识。将所有染色的肺组织平板整齐排列在干净、明亮的平面上。

在光线充足的区域拍摄培养皿集合的照片，注意尽量减少反光。培养皿中的反光会影响图像分析，应予以避免。仔细检查所拍摄的照片，并从多个角度拍摄多张照片。

拍摄完平板后，裁剪图像以去除盖子或背景中的任何物体。在 Fiji ImageJ 中打开图像，并通过点击图像、调整、颜色阈值，将其更改为黑白图像。然后选择默认的阈值方法、黑白作为阈值颜色，以及 lab 作为颜色空间。

确保未选中深色背景框。此时图像应为黑白显示，黑色代表浅色背景，白色代表蓝色的转移性克隆集落。

使用圆形工具选择待分析区域。绘制一个圆形，并将其用于所有培养皿，以确保每个培养皿的分析区域面积相同。选择的圆形大小应尽可能最大化培养皿上的分析区域，同时尽量减少培养皿边缘的背景噪声。

绘制时，尺寸会显示在工具栏中。分析所选的圆形，以确定白色区域所占的百分比。点击“Analyze”（分析），选择“Analyze Particles”（分析颗粒），然后尺寸范围选择0到无穷大，圆度范围选择0到1，显示选项不作选择。

勾选摘要框并点击确定。通过抓取圆圈中心，将其移动到图片中的下一个孔板，然后重复分析。将结果复制并粘贴到电子表格中。

百分面积是指所选区域中呈白色部分所占的百分比，代表转移负荷。在完成所有培养板和图像的分析后，对每块板的不同图像之间的百分面积结果取平均值，以减少图像间可能存在的不一致性。Fiji ImageJ 分析结果与人工计数及组织病理学分析进行了比较。

当三名不同的研究人员手动计数转移性克隆时，计数结果在不同计数者之间存在不一致。使用Fiji ImageJ分析时，三幅图像在不同计数者之间的结果均保持一致。每块肺组织平板的结果均综合了三幅图像和三名计数者的数据。

对每块培养板的结果进行平均，以消除图像间的差异，从而在不同计数者之间获得一致的结果。在将培养板按转移性从高到低排序时，人工计数仅在最融合的培养板上达成一致，其余所有排序均不一致。而采用 Fiji ImageJ 平均结果所得出的排序在不同计数者之间则具有更高的一致性。

为了说明避免图像中出现反射的重要性，此处展示了一张包含手部反射的图像及其后续的 Fiji ImageJ 分析结果，同时展示了一张无反射的相同培养板图像。来自脏污背景表面的深色瑕疵或培养板上残留的血样也可能对 Fiji ImageJ 分析产生负面影响。该血样培养板实际上仅有两个转移性克隆，但由于深色残留物，Fiji ImageJ 将其判定为 31.6% 转移性。

进行该实验方案时，请务必仔细检查图像是否存在反光，对图像中每个平板使用相同大小的圆圈，并对每个平板至少三张独立图像的结果进行平均。