鼻腔刷取采样及利用数字高速纤毛视频显微镜进行处理——针对新冠疫情的适应性改进

由于缺乏已发表的正式操作规程和标准化流程，数字高速视频显微技术尚不能被视为原发性纤毛运动障碍的确认性诊断方法。此外，为在当前新冠肺炎疫情危机期间持续提供诊断服务，纤毛视频显微技术的操作方案已进行了调整，纳入了充分的感染控制措施。利用数字高速视频显微技术进行纤毛功能评估对原发性纤毛运动障碍的诊断具有高度的敏感性和特异性。

与其他原发性纤毛运动障碍诊断方法相比，数字高速视频显微镜检查操作相对简便、成本较低，且检测结果可在当天获得。数字高速视频显微镜检查在原发性纤毛运动障碍的诊断中具有更高的敏感性和特异性。目前，仅有电子显微镜和基因检测被认可作为原发性纤毛运动障碍的确诊手段，但这些检测方法仍可能漏诊15%至30%的患者。

演示鼻腔刷取操作的是来自我实验室的耳鼻喉科住院医师 Lionel Benchimol。在采集鼻腔样本前，让患者先擤鼻。清理鼻腔通道后，让患者舒适地仰卧或坐着，头部向后靠稳。

将细胞刷在添加了补充物的Medium 199培养基中轻轻震荡以润湿，然后将内窥镜置于鼻孔入口处，以观察下鼻甲。将细胞学刷插入鼻腔，于下鼻甲后段区域前后移动刷子数次，随后退出。将刷子放入含有M199培养基的试管中。

将导丝剪短至可完全放入管内，然后立即盖紧管子。接着，将样本置于密封的双层袋中。在样本采集后九小时内，在微生物安全柜中打开样本管，使用Weil-Blakesley鼻用镊子搅动拭子，使采集到的上皮条脱落。

将双面胶垫粘贴到载玻片上，并移除胶垫的保护膜。轻轻振荡试管，使纤毛均匀分散于整个试管中，然后使用移液器从试管中部转移约60微升的纤毛上皮组织至胶垫内。将一块22毫米×4毫米的矩形盖玻片放置在胶垫上以封闭样品室，随后用70%乙醇对载玻片进行消毒，再将其从生物安全柜中取出。

更换手套后，将此载玻片置于加热盒的载物台上，并盖上盖子。在油浸物镜上滴加镜油，然后将加热盒放置在正置或倒置光学显微镜的载物台上。打开加热盒和物镜加热器，并调节加热盒及物镜加热器控制器上的温度设置。

五分钟后，调整物镜位置，使其镜头尖端恰好接触盖玻片。为观察样本中呼吸纤毛边缘，打开相机软件，然后使用显微镜物镜手动定位样本内的细胞，并将细胞成像投射到显示器上。检查图像是否在显示器上可见，并根据需要调节聚光镜和物镜焦距，以提高图像质量。

当定位到纤毛上皮条带后，仅选择长度至少为50微米、完整且未受破坏的纤毛上皮边缘。务必仅使用正常边缘或带有轻微突起的边缘进行纤毛功能分析，排除具有明显突起的纤毛边缘，以及孤立的纤毛细胞或彼此之间及其他细胞类型之间无接触的单个细胞。选定合适的边缘后，使用每秒500帧的相机帧率记录纤毛摆动边缘约两秒钟。

在侧面记录至少六个良好的纤毛边缘后，将载玻片从加热箱中取出，并将载玻片、盖玻片和垫片放入一个密封袋中。然后将手套和口罩也放入袋中，并将袋子放入适当的医疗危险废物容器内。为分析纤毛摆动频率，使用合适的视频分析软件打开录像，并将纤毛边缘划分为大约五个相邻的、每个约10微米的区域。

以降低的帧率识别并可视化纤毛或纤毛群，每个区域最多进行两次纤毛摆动频率测量，以获得每条边缘最多10次纤毛摆动频率测量值。记录一组纤毛完成五个摆动周期所需的帧数，并使用公式计算纤毛摆动频率。为确定样本中每种独特纤毛摆动模式所占的百分比，需针对每根纤毛或每组纤毛，将其在一个完整摆动周期中的精确运动路径与数字高速视频显微分析中观察到的正常纤毛摆动模式进行比较。

为每根或每组分析的纤毛指定一种独特的纤毛摆动模式，例如正常、僵硬、不动、不同步或运动失调，以及环形运动等。然后计算每种独特纤毛摆动模式在每个样本中所占的百分比。样本的纤毛摆动模式由观察到的主导纤毛摆动模式确定。

在此，我们观察了14名成年志愿者鼻刷样本的纤毛功能分析详细结果。从这14份鼻刷样本中，共记录了242条纤毛边缘，其中212条符合预设的纳入标准并用于分析。对所分析的纤毛或纤毛群共获得了807次纤毛摆动频率测量值及纤毛摆动模式评估结果。

平均不动指数与既往在健康志愿者中观察到的数值相似。纤毛摆动频率和运动障碍评分在仅选择正常边缘或具有轻微突起的边缘时，与既往报道的数值相近。当使用低质量边缘时，报告的纤毛摆动频率较低，而运动障碍评分较高。

过于用力刷取所获得的血细胞和黏液可能会阻碍纤毛的自由摆动，或遮挡观察者的视野而无法看到纤毛。相反，如果刷取时刷头未紧贴下鼻甲，则样本中可能缺乏足够数量的高质量带纤毛的上皮条带。此外，若鼻腔刷取操作位于鼻腔前部，则仅能获得移行型的无纤毛上皮细胞。

该方案中最重要的两个方面是鼻腔刷取的质量以及高质量上皮片段的选择，以避免出现完全阳性结果或技术失败。