从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

本方案提供了一种简单策略，用于建立能够真实体外重现体内脂肪组织生理特性的白色和棕色脂肪细胞培养模型。该方案可从新生小鼠中同时分离白色和棕色前体脂肪细胞，所获得的细胞具有较高的增殖能力和分化潜能。采用此方法分离的细胞相较于其他培养模型，更能反映脂肪组织的复杂性。

并且可用于更准确地研究肥胖症和糖尿病中脂肪细胞的功能。我们的研究主要集中在理解肥胖症中的脂肪组织功能障碍。然而，利用此方法制备的细胞也可用于研究发育生物学中有关细胞的基本问题。

成功实验的关键在于确定如何识别白色脂肪组织库，因为这些脂肪库体积较小，但富含且大量增殖的前脂肪细胞，在幼鼠中可能难以区分。通过直观演示可说明该操作步骤的简便性，并提供定位和解剖白色及棕色脂肪组织库的实用技巧。观察脂肪库的分离过程非常有帮助。

为采集皮下白色脂肪组织，剪开安乐死后的新生幼鼠腹部周围的皮肤，并轻轻将腿部下方的皮肤拉开。在不采集任何皮肤组织的情况下，小心地分离脂肪组织库，该组织呈透明或白色、薄而细长，附着在皮肤内侧或股四头肌表面。用 PBS 冲洗所采集的脂肪组织库，并将脂肪组织置于预冷的 1.5 毫升离心管中，管内含有 250 微升 PBS 和 200 微升 2X 分离缓冲液，冰上保存。

为采集肩胛间棕色脂肪组织，将肩胛骨处的皮肤翻过头部，暴露位于肩胛骨之间的深红色棕色脂肪组织。仔细在脂肪组织周围进行切开，将其从机体上分离，并检查组织的一致性和颜色。用PBS冲洗后，将组织置于另一含有250 µL PBS和200 µL 2X分离缓冲液的1.5 mL离心管中，冰上保存。

当收集完所有脂肪组织后，用剪刀在离心管内将每份组织轻轻剪碎4到6次，并向每根离心管中加入50微升含有10倍浓度胶原酶的2倍分离缓冲液。然后快速颠倒混匀离心管，将组织置于温度可控的振荡器中，在37摄氏度、每分钟1400转的条件下孵育30分钟。消化结束后，将离心管放回冰上，通过100微米细胞筛网将消化后的组织过滤至新的50毫升离心管中。

为最大化细胞产量，用一毫升分离培养基冲洗每根试管，并将冲洗液通过滤网过滤。用新鲜的分离培养基将棕色和白色脂肪组织溶液稀释，使每个储库每孔的组织悬液体积为两毫升。然后，通过每个孔放置一个100微米滤网，将两毫升白色脂肪组织悬液接种至六孔板中的四到六个孔，将两毫升棕色脂肪组织悬液接种至两到三个孔。

所有细胞接种完成后，将培养板放入细胞培养箱中孵育60至90分钟。孵育结束后，用2毫升无血清培养基洗涤每个孔，并轻轻振荡培养板，以使任何附着在孔底的血细胞脱落。经过三次洗涤后，向各孔中加入2毫升新鲜的分离培养基，并将培养板放回细胞培养箱中继续培养。

当细胞达到80%至90%融合度时，在37摄氏度条件下用无菌的0.1%明胶水溶液对新的目标培养板进行包被，孵育10分钟。在培养板孵育的同时，在细胞培养孵箱中用PBS洗涤细胞，随后用胰蛋白酶处理3分钟。当细胞脱落后，反复吹打细胞悬液数次以最大程度回收细胞，并将细胞转移至新离心管中。

当所有细胞收集完毕后，用一毫升分离培养基洗涤每个孔，并将洗涤液与细胞悬液合并。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于三至五毫升分离培养基中，进行细胞计数。用新鲜的分离培养基将细胞稀释至适当的浓度，用于接种，并用 PBS 洗涤明胶包被的培养板，以去除多余的明胶。

然后将细胞接种到明胶包被的培养板上，并将细胞放回细胞培养孵育箱中。当细胞达到汇合状态时，用分化培养基替换分离培养基。若对棕色脂肪组织前脂肪细胞进行分化，还需添加1纳摩尔的三碘甲状腺原氨酸。

48小时后，根据每份培养物的适当体积更换为维持培养基。此时，在明场显微镜下应可观察到细胞内出现微小液滴的聚集。即使经过过滤，细胞悬液中仍会残留部分细胞碎片和血细胞。

接种后一小时进行轻柔洗涤，可去除不相关的细胞，因为前脂肪细胞会迅速贴附于孔板底部。尽管从新生幼鼠中分离的白色和棕色前脂肪细胞均具有较高的增殖能力，但按每个脂肪库计算，白色前脂肪细胞的产量通常为棕色前脂肪细胞的两倍。因此，若需要同步培养，白色前脂肪细胞的起始密度必须据此进行相应计算。

分化结束时，细胞将充满脂滴，并分别表达白色和棕色脂肪细胞的经典标志物。在此针对原代白色和棕色脂肪细胞在线粒体应激测试中基础状态下的耗氧量，以及对已知线粒体功能刺激物反应的比较分析中，可以观察到每种细胞类型的特定生物能量特征。请记住，我们分离的是活细胞，并希望将其培养数天。

因此，在分离过程中务必保持无菌条件，以避免污染，否则可能影响后续培养。该方法可获得完全成熟的脂肪细胞，可用于多种应用，包括功能检测、基因或化学筛选，以及组学分析，以研究影响脂肪细胞功能的细胞自主性机制。