使用微生理系统在人乳腺组织中建立乳腺癌模型

这是首个能够将人类乳腺组织在体外长期维持存活的实验方案，从而直接促进对人类乳腺组织与人类乳腺癌之间相互作用的研究。该技术的主要优势在于，它能够使包含乳腺脂肪细胞、免疫细胞、血管结构、导管结构以及细胞外基质在内的大块人类乳腺组织在体外保持活性。该技术对多个乳腺癌研究领域具有重要意义，包括个体化医疗、药物开发，以及肿瘤发生机制和较慢性的乳腺癌相关过程（如纤维化和细胞外基质重塑）的病理生理学研究。

本实验操作由本实验室的杜兰大学研究生凯瑟琳·赫伯特（Katherine Hebert）以及杜兰大学医学院学生拉凯什·古拉拉（Rakesh Gurrala）示范。首先，将制备好的明胶溶液置于37摄氏度水浴中融化。使用5或10毫升的血清移液管，将2.5毫升该溶液分别加入六孔板每个孔的活塞上。

待明胶凝固后，将带有 pNIPAAm 编码的 ASC 培养板转移至生物安全柜中。轻轻将柱塞放入培养板的孔中，使明胶接触 ASC。在柱塞上放置一个金属垫圈以增加重量，确保明胶与 ASC 单层直接接触，在室温下维持 30 分钟。

在生物安全柜中，轻轻将带有柱塞的培养板放入无菌盒内，并盖上盖子。将盒子移至4°C冰箱，或将培养板置于生物安全柜中的冰盒冰上，静置30分钟。在生物安全柜中，用10毫升无菌PBS清洗人乳腺组织三次。

使用无菌镊子和剃刀片将乳腺癌转移灶组织（BC-MPS）进行粗略剪切，并尽可能去除筋膜和结缔组织。待结缔组织去除后，使用无菌剃刀片将组织进一步剪切至呈现均一的液状质地。剪去P1000移液器吸头的尖端，以协助移取剪切后的组织。

在1.5毫升离心管中，按照文稿所述，将切碎的组织、癌细胞系和BC-MPS培养基混合。将用于底部细胞层的ACS板从培养箱转移至生物安全柜中，并吸除板中的培养基。使用剪切过的移液枪头，将制备好的乳腺组织混合物滴加到底部ACS板孔的中央，然后将装有带活塞上层ACS板的盒子移至生物安全柜中。

轻轻将明胶柱塞从 pNIPAAm 涂层板上取下，并将其放置在组织混合物上方。向孔中加入 BC-MPS 培养基，小心地将含有 BC-MPS 混合物和柱塞的底部 ACS 板转移至无菌塑料盒中。盖上盒子的盖子进行运输，注意避免培养物受到污染。

将底部培养板放入盒子中，并置于37摄氏度培养箱内孵育，直至明胶完全融化且顶部ACS层开始与底层粘附。随后将装有培养板的盒子转移至生物安全柜中，轻轻取出底部培养板中的柱塞，以观察锚定于孔底部的癌细胞组织。将六孔板的盖子重新盖回底部培养板上，于37摄氏度继续孵育，使明胶完全融化，并让顶部层充分锚定于底层。

将培养板轻轻转移至生物安全柜中，使用10毫升血清移液管从孔的边缘吸出培养基。在每个孔的边缘加入2毫升新鲜培养基，以避免组织移位。将BC-MPS在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养所需的时间。

每两到三天更换一次培养基。当BC-MPS准备进行分析时，将培养板转移至生物安全柜中。使用血清学移液管移除培养基，以避免意外扰动任何组织。

向每个孔中加入一倍体积的 PBS。然后用刻度移液管吸除 PBS。向每个孔中加入 1 毫升细胞解离溶液，并将培养板放回培养箱中孵育 5 分钟，以使细胞脱落。

孵育后，在生物安全柜中使用细胞刮刀将细胞和组织从培养板上完全刮下。将含有组织的溶液转移至15毫升锥形管中，并加入2毫升PBS收集残留的细胞。如果细胞具有荧光，请用铝箔包裹试管。

将试管置于37摄氏度下，在轨道摇床中以1 × g的转速持续振荡孵育10至20分钟，以彻底使细胞从组织中解离。在生物安全柜中，使用血清学移液管将试管中任何残留的细胞团块打散。然后通过250 µm的组织筛网将样品过滤至新的15 mL离心管中。

用一毫升磷酸盐缓冲液冲洗滤网，以收集任何残留的细胞。在室温下以500 × g离心样品五分钟，使脂肪细胞（位于上层液体中）与细胞沉淀中的癌细胞和ASCs分离开。使用去尖端的移液器吸头将脂肪细胞层转移至新的离心管中。

再次离心样品，使用注射器和针头从脂肪细胞下方移除残留溶液。从含有ASCs和癌细胞的试管中吸取残留溶液，注意不要扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于PBS或BC-MPS培养基中，利用流式细胞术根据荧光信号对细胞进行分选。

此处展示了融合的ASC细胞片的条带辅助排列模式。经过14天培养后，漂浮的人类乳腺组织仍通过ASC细胞片稳定地锚定在培养孔底部。荧光显微镜图像显示，在培养14天后，表达RFP的MDA-MB-231细胞系构建的BC-MPS保持稳定；三阴性肿瘤组织来源的PDX模型在至少6天内也保持稳定。

含有乳腺组织的BC-MPS在体外培养14天后进行染色和成像，以在100倍和20倍放大倍数下展示组织的天然组分。通过巨噬细胞标志物的染色，显示原代巨噬细胞在培养第3天和第7天后仍得以保留。经Bodipy染色的MDA-MB-231细胞在培养14天后进行流式细胞术分析，结果表明在2D培养条件下脂质积累极少，而在BC-MPS中则出现大量脂质积累。

在BC-MPS中，脂质阳性的MDA-MB-231细胞比例比2D培养条件下高26.2倍。与标准2D培养的细胞相比，BC-MPS中培养的细胞显示出更多的脂滴。用RFP标记的含MDA-MB-231细胞的BC-MPS的延时成像显示，231细胞呈现阿米巴样运动，具有伪足并表现出高迁移能力。

乳腺组织必须被切碎至足够小并充分分散，以便均匀分布于孔板底部。乳腺组织具有较强的浮力，如果组织块过大或过于密集地聚集在一起，ASC细胞层将无法将乳腺组织固定在孔板底部。所形成的乳腺组织癌构建体可经过酶消化处理，以分离出特定的感兴趣细胞类型。

这将有助于回答一些关键问题，例如乳腺组织中的癌细胞对化疗的反应与传统二维培养或类器官相比有何不同。