利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

我们采用此方案将患者皮肤成纤维细胞转化为神经前体细胞，以研究神经及神经退行性疾病。我们认为，与传统的诱导多能干细胞（iPS）技术相比，该方案具有诸多优势，包括更快的转化速度，以及在某些情况下能够获得更显著的疾病表型。我们致力于神经及神经退行性疾病的研究，而利用皮肤样本使我们能够充分评估患者群体的多样性。

我们的实验室特别关注星形胶质细胞在疾病中的作用，我们利用由NPCs诱导而来的星形胶质细胞来测试药物，研究疾病机制，同时也将其与人和小鼠的神经元进行共培养。希望本实验方案对您有所帮助，若您有任何疑问，欢迎随时联系。谢谢。

使用可从细胞库或皮肤活检获取的原代人皮肤成纤维细胞。在37摄氏度、5% CO2的组织培养孵箱中培养细胞。细胞复苏后，实验前至少传代一到两次。

细胞准备好后，在室温下用 PBS 以 1:200 的浓度将人纤维连接蛋白包被六孔板的一个孔，孵育 15 至 20 分钟。按照表一配制成纤维细胞培养基。当细胞准备接种时，从培养皿中移除纤维连接蛋白，并立即加入细胞悬液或 2 mL 成纤维细胞培养基。

在添加培养基之前，切勿让培养皿干燥。根据细胞生长速度，将150,000至200,000个成纤维细胞接种于经人纤维连接蛋白包被的六孔板中的两个孔内。在37°C、5%CO2的组织培养孵箱中培养细胞。

接种后的第二天，在显微镜下观察成纤维细胞，确认细胞密度在70%至85%之间。使用四种逆转录病毒载体Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc对其中一个孔的细胞进行转导。对于生长较快的成纤维细胞，感染复数（MOI）设为10；对于生长较慢的成纤维细胞，MOI设为15。每种载体的转导效率必须超过70%，即阳性细胞比例达到70%或以上。

向病毒混合物中加入常规成纤维细胞培养基，使每孔总体积达到1 mL。第二孔不作处理，将细胞放回组织培养孵育箱中过夜孵育。转导后的第二天，用PBS洗涤细胞一次，并加入1 mL新鲜成纤维细胞培养基。

在37摄氏度、5% CO2的组织培养箱中培养细胞。次日，按表一配制转化培养基，用PBS洗涤细胞一次，以去除残留的成纤维细胞培养基，随后加入1毫升转化培养基。同时将未处理孔中的培养基更换为转化培养基。

在显微镜下观察细胞，并注意其形态变化。在整个转化过程中，每天应更换一次至两次转化培养基，后续iNPC培养也需每日更换培养基。换液时，小心移除孔中70%的培养基，同时确保细胞仍被剩余30%的培养基覆盖。

继续观察细胞，并每天使用一到两毫升转化培养基更换培养液。在转化培养基中培养约五到六天，或当细胞变得非常密集时，以1:2至最多1:3的比例传代。将Accutase预热，并在六孔板中用一毫升总体积的纤连蛋白溶液（以PBS按1:200稀释）室温孵育15至20分钟，包被适量的孔。

用 PBS 轻柔洗涤细胞，注意不要使任何细胞脱落。将 PBS 沿着孔壁轻轻加入，避免直接冲击细胞。使用移液器或抽吸法小心移除 PBS。

加入 500 µL Accutase，在组织培养孵箱中 37°C 孵育 2 至 3 分钟。在显微镜下观察，确认大多数细胞已脱落。若细胞已脱落，加入 2 mL 新鲜转化培养基，轻轻吹打 2 至 3 次以解离细胞团块。

将细胞收集到15毫升离心管中，并加入3毫升培养基以进一步稀释Accutase。在室温下以200 × g离心4分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1毫升新鲜培养基中。

轻轻吹打混匀两到三次，以分散细胞团块。去除已包被六孔板中的纤连蛋白，并立即向每孔加入1 mL新鲜培养基。按1:2比例传代时，将500 µL细胞悬液加入一个孔中，另500 µL加入第二个孔中。

轻轻摇晃六孔板，使细胞在南北和东西方向上均匀分布，然后放入37摄氏度的组织培养箱中。次日在显微镜下观察细胞，并更换1至2毫升培养基。每天更换培养基，直至细胞准备再次传代。

配制含有高浓度 FGF 但不含 EGF 或肝素的 NPC 培养基，如表一所示。在此新传代时，将细胞分别接种于转换培养基和 NPC 培养基中，各接种一孔。每日更换 iNPC 培养基，每次加入 1 至 2 毫升 NPC 培养基。

根据表一配制星形胶质细胞培养基。若要从新鲜的iNPCs制备星形胶质细胞，可将iNPCs直接接种于10厘米纤维连接蛋白包被的培养皿中，加入10毫升星形胶质细胞培养基，使细胞密度在次日达到约10%融合度。将细胞置于37摄氏度、5% CO2的组织培养孵箱中培养。

铺板后三天，更换为10毫升星形胶质细胞培养基。继续培养细胞使其分化5至7天。为实验接种，使用胰蛋白酶或Accutase按照步骤2至2.6所述方法对星形胶质细胞进行传代。

推荐的接种密度见表二。将iNPCs分化为诱导型星形胶质细胞的操作步骤见表三。若要从冻存的iNPCs储备中制备星形胶质细胞，需从液氮储存罐中取出相应储备管，并在37摄氏度下快速解冻。

细胞解冻后，立即将细胞悬液用移液器转移至含有5 mL星形胶质细胞培养基的15 mL离心管中。在室温下以200 × g离心4分钟。弃去上清液，并用1 mL新鲜星形胶质细胞培养基重悬细胞。

向一个纤维连接蛋白包被的10厘米培养皿中加入9毫升新鲜星形胶质细胞培养基，并加入1毫升细胞悬液，轻轻以南北-东西方向均匀分布细胞。将细胞置于37°C、5%CO2的组织培养孵箱中培养。该方案可利用含有Yamanaka因子的逆转录病毒，直接从人皮肤成纤维细胞快速、简便地生成诱导性神经前体细胞（iNPCs）。

该方法能够绕过干细胞状态以及克隆筛选的需要，从而避免克隆变异。在细胞转化过程中需重点关注的关键步骤包括成纤维细胞的接种密度、培养基 pH 值，以及维持细胞处于最佳汇合度。转化过程中最佳汇合度及形态变化的示例见图一。

转化过程完成后，神经前体细胞（NPCs）将表现出成纤维细胞标志物及其形态的显著降低或完全不表达，同时表达NPC特异性的细胞标志物。此外，这些细胞还可用于生成不同类型的细胞系，如诱导神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。根据我们的经验，尤其是诱导产生的星形胶质细胞在药物筛选和疾病机制研究中具有重要价值，因其能够以高重复性获得大量纯化的细胞群体。

可通过在传代时取少量细胞或使用先前冻存的iNPC部分，直接接种于星形胶质细胞培养基中，从而将诱导性星形胶质细胞从iNPCs分化而来。此过程中的重要考虑因素包括：保持iNPCs的初始接种密度较低，因为高接种密度已被证明会阻碍分化过程；同时需特别注意培养基的pH值，因为酸化可能激活即使是健康的星形胶质细胞。总之，直接转化方案是一种从患者皮肤样本快速制备神经前体细胞的高效方法。

这使得能够同时研究更大量的细胞样本，并真正观察疾病背景下的细胞多样性。我们认为这是一种非常强大的检测方法，可用于生成神经前体细胞、神经元，以及星形胶质细胞，这些细胞可单独使用或用于共培养，以进行药物测试或机制研究。