基于CLARITY优化的组织透明化技术用于小鼠健康与损伤心脏中三维成纤维细胞结构的研究

这种新型组织透明化方案改进了现有技术，能够更准确地在活体条件下观察心脏中特定细胞类型及其在损伤状态下的行为。该方案快速且相对简便，可在无需对细胞或组织进行染色的情况下，有效维持标记荧光信号，同时最大限度减少背景组织自发荧光的干扰。

首先使用经70%乙醇浸润的纱布擦拭实验小鼠的腹侧表面。用手术剪在剑突下方约三厘米处做一条三厘米长的横向切口，从腹部向剑突方向剥离皮肤，使其与腹壁下层组织分离。在剑突下方三厘米处的腹壁皮下组织上做一条两厘米长的横向切口，然后从此切口沿中线向上经肋骨区域做一纵向切口。

固定肋骨以暴露心脏。使用带有27号针头的10毫升注射器，将冷的磷酸盐缓冲液注入上腔静脉和主动脉。当心脏中的血液完全冲洗干净后，向上腔静脉和主动脉注入10毫升冰冷的4%多聚甲醛溶液，以开始固定过程。

当所有固定液冲洗完毕后，切除心脏，并使用直刃解剖刀将心房、右心室和室间隔与左心室分离。将心脏放入含有15毫升冷4%多聚甲醛（PFA）的锥形管中，在4摄氏度条件下于摇床上避光孵育过夜。次日早晨，向新配制的水凝胶溶液中加入0.25%光引发剂溶液，然后将心脏转移至该水凝胶溶液中。

将锥形管用锡箔纸包裹，在 4 摄氏度条件下过夜孵育，避免物理扰动。次日早晨，将管子置于 37 摄氏度的金属珠浴中温育 2.5 小时，然后用镊子小心地将心脏转移至含有 PBS 的 15 毫升离心管中。在 37 摄氏度条件下，于旋转摇床上用 PBS 洗涤心脏三次，每次一小时，随后将心脏转移至活性电泳仪的篮筐中。

固定好盖子，并用电泳清洗液注满活性电泳室的储液槽。待储液槽充满后，将篮子浸入溶液中，并拧紧电泳仪上的盖帽。然后以 1.5 安培、37 摄氏度运行电泳仪 1.5 小时。

电泳后，肉眼观察心脏组织，确保无浑浊组织残留。将透明化的心脏在15毫升离心管中用新鲜PBS缓冲液于37摄氏度下在旋转仪上清洗三次，每次一小时。在将心脏浸入脱色剂以降低血红素自发荧光之前进行此步骤。

48 小时后，用 PBS 清洗心脏三次，如图所示，并在成像前将心脏置于新配制的 RIMS 中平衡 48 小时。对于透明化心脏的 3D 成像，首先，在 3D 打印的底部储液池底部涂上一层与待成像样品等高的真空脂。用 RIMS 填充储液池，并使用移液器吸头去除所有气泡。

将心脏小心地放入RIMS中，使左心室壁朝上，并注意避免向溶液中引入气泡。使用真空润滑脂将玻璃盖玻片固定在3D打印的上部储液槽部件的底面，然后将上部储液槽的盖玻片朝下放置在下部储液槽上，注意避免产生气泡。随后，用甘油填充上部储液槽。

使用共聚焦显微镜对透明化处理后的心脏进行成像。结合优化的心脏组织透明化技术与三维成像，可实现对心肌成纤维细胞的高精度详细可视化。利用该成像技术，可观察到在未受伤的心脏中，成纤维细胞排列紧密，呈纺锤形形态。

缺血再灌注损伤后，在损伤后的最初三天内，缺血区域可见心肌成纤维细胞数量减少。至第7天和第14天，成纤维细胞已迁移或增殖，重新填充受损组织区域。到第28天，心脏损伤区域周围的心肌成纤维细胞密度达到最高水平。

心肌梗死损伤后一天半，损伤的左心室内仅存少量成纤维细胞。然而到第三天，成纤维细胞数量扩增，遍布左心室的大部分区域。与缺血性手术不同，持续数周输注血管紧张素II和去氧肾上腺素不会导致心肌组织丢失和心室壁变薄。

相反，成纤维细胞会沿着右手螺旋收缩模式的轴向排列，这在优化后的组织透明化方案中可以观察到。此外，在血管紧张素Ⅱ和去氧肾上腺素处理后，成纤维细胞呈现较小且圆形的形态，与缺血再灌注及心肌梗死损伤模型中观察到的梭形形态相反。电泳透明化过程需谨慎操作，尤其是在处理经过损伤干预的心脏组织时。

该方案可用于评估心肌成纤维细胞在体内的损伤反应。此外，还可使用不同的荧光标记物来理解心脏在细胞水平上对损伤的响应机制。