利用单卵母细胞报告基因检测法定义体外成熟过程中母源mRNA翻译程序

该方法可用于鉴定和表征在卵母细胞成熟过程中调控翻译的调控元件。我们采用延时显微镜技术，以评估体外卵母细胞成熟全过程中的报告基因累积情况。该方法能够精确定位卵母细胞成熟过程中翻译激活或抑制发生的时间点。

首先，使用26号针头在卵泡壁上做一个小切口，小心地打开窦状卵泡。用口控玻璃移液管分离带有数层卵丘细胞的完整卵母细胞-卵丘复合体（COCs）。使用较小的移液管，通过反复吹打，机械去除COCs的卵丘细胞。

吸除去除了颗粒细胞的卵母细胞，并将其放入含有1微摩尔西洛他唑的成熟培养基的培养皿中。将培养皿置于培养箱中孵育2小时，使卵母细胞从卵泡分离所引起的应激状态中恢复。将一根10厘米长的硼硅酸盐玻璃毛细管插入机械拉针仪中，以制备显微注射针。

使用加热的细丝将针尖弯曲成45度角，以实现最佳注射效果。在聚苯乙烯培养皿中放置20微升碱性卵母细胞收集培养基液滴，并用轻质矿物油覆盖液滴。通过加入每微升12.5微克的Ypet UTR和mCherry，制备较大量报告基因混合物。

将这些样品分装后于-80摄氏度保存。解冻后，以20,000 × g离心2分钟，然后转移至新的微量离心管中。用注射针头吸取约0.5 µL报告分子混合液。

将持卵管和注射针放入固定架中，并置于卵母细胞收集液滴内。轻轻敲击注射针与持卵管接触，以打开注射针。将卵母细胞置于基础收集液滴中，注入5至10皮升报告分子混合液。

将卵母细胞和成熟培养基与1 µM cilostamide共同孵育16小时，使mCherry信号达到平台期。进行活细胞延时显微成像时，为每种注射了报告基因的样本准备一个培养皿，其中包含两滴20 µL的成熟培养基：一滴含有1 µM cilostamide，用于对照组处于前期I期阻滞的卵母细胞；另一滴不含cilostamide，用于培养成熟的卵母细胞。用轻质矿物油覆盖液滴，并将其置于培养箱中。

预孵育后，将显微注射后的卵母细胞从培养箱中取出，在不含西洛他唑的成熟培养基中洗涤四次。保留部分卵母细胞于含1微摩尔西洛他唑的成熟培养基中，作为前期I卵母细胞对照组。将注射后的卵母细胞转移至预先准备好的延时显微镜培养皿中的相应液滴中。

使用封闭的玻璃移液管将卵母细胞聚集在一起，以防止记录过程中细胞移动。将培养皿置于配备有发光二极管消除系统和电动载物台的显微镜下，电动载物台配备环境培养室，维持在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，具体参数参见正文手稿。通过点击“Apps”然后选择“Multidimensional Acquisition”，设置延时实验的相应参数。

选择第一个选项卡“Main”，并选择延时成像、多个载物台位置和多个波长。选择“Saving”选项卡以输入实验数据的保存位置。然后选择“Time-Lapse”选项卡，输入时间点数量、持续时间和时间间隔。

选择“Stage”选项卡，打开明场，通过新建窗口并选择“Acquire”、“Acquire”和“Show Live”来定位卵母细胞的位置。找到卵母细胞后，切换回多维采集窗口，按加号键设置卵母细胞的位置。选择“Wavelengths”选项卡，并为明场、YFP 和 mCherry 设置三个不同的波长。

调整 Ypet 和 mCherry 的曝光参数，然后点击“Acquire”开始延时实验。对于 Ypet 三端非翻译区（3' UTR）翻译的分析，对每个卵母细胞进行两个区域的测量：通过点击椭圆区域选择卵母细胞本身，再通过点击矩形区域选择卵母细胞周围的一个小区域，用于背景扣除。通过点击“Open Log”，然后点击“Log Data”，将区域测量数据导出至电子表格中。

针对每个卵母细胞以及所有测量的时间点，分别对YFP和mCherry波长，从卵母细胞区域的测量值中减去背景区域的测量值。在39个卵母细胞中记录了mCherry和YFP在第一次减数分裂前期及成熟过程中表达情况，其中30个进入成熟阶段，9个停滞于第一次减数分裂前期作为阴性对照。通过将YFP信号除以第一次减数分裂前期停滞和成熟卵母细胞最后10个时间点的平均mCherry信号，对第一次减数分裂前期停滞和成熟卵母细胞信号的单个YFP与mCherry比值进行注射体积校正。

通过线性回归拟合减数分裂前期 I 以及在释放 cilostamide 后的 0 至 2 小时或 8 至 10 小时内成熟卵母细胞中 YFP 与 mCherry 的比值，测定报告基因 YFP 的翻译速率。报告基因的累积并不呈现线性模式，因为在释放 cilostamide 后 0 至 2 小时与 8 至 10 小时之间的翻译速率存在显著差异，表明在卵母细胞减数成熟过程中白细胞介素 7 的翻译被激活。在实施本方案时，请确保记录开始时的曝光时间充足。

请注意，如果在卵母细胞减数分裂恢复期间激活翻译，信号可能在时间过程中达到饱和。可通过使用YFP引物进行PCR来确认MRMA的稳定性。为验证翻译水平的变化，可使用抗V5标签抗体进行蛋白质印迹（Western blotting）。