使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

黑质中多巴胺能神经元数量的估算在帕金森病研究中是一项关键的结局指标。该方案显著缩短了估算神经元数量所需的工作量。该方法提供了一种高效且准确的流程，用于检测多巴胺能神经元数量的变化，适用于评估干预措施对细胞存活的影响。

该方法可轻松改进，用于准确计数不同脑区的神经元，同时相比传统体视学方法具有成本和时间上的优势。使用与共聚焦显微镜配套的软件，以10倍放大倍数采集免疫组化图像。将针孔开至1.5个面积单位，以捕获总计1.5微米的宽焦平面，并将焦点置于脑部注射侧。

在采集选项卡中，选中图块扫描成像选项，并将尺寸设置为10乘以4。在采集模式面板中，将缩放倍数设置为1.1，以避免图块扫描图像之间出现拼接痕迹。将帧大小设置为1024乘以1024像素，平均次数设置为2，以确保获得高质量的图像。

在通道面板中，将第一轨设置为 Alexa 488，第二轨设置为 Alexa 555。将玻片载入载物台，选择 TH 染色较强的区域。在采集面板上点击“实时”按钮。

在通道面板中，将激光强度和增益调节至最大化信号并限制背景噪声的水平。使用范围指示器确保信号未过曝。对多张切片重复此操作。

在采集选项卡中勾选位置框。开始成像时，通过目镜观察并选择显示阳性TH染色的第一个区域。然后将焦点设置在感兴趣的位置，并移动载物台至该切片的中线处。

保存X、Y和Z轴的位置，并进行图块扫描成像以覆盖整个切片区域。对所有其他载玻片（包括未注射位点）重复此操作。使用适当的软件将图像文件分开，并导入自动图像分析软件中。

通过选择笔标注工具，在黑质致密部周围绘制标注，以定义感兴趣区域。转到分析选项卡，从下拉分析菜单中选择实时调谐。这将在切片图像上打开一个独立的窗口，允许实时修改分析参数。

在分析放大倍数部分，选择合适的图像缩放比例。在细胞检测部分，选择核染料作为用于TH染色的染料。在仔细观察时间调谐窗口的同时，调整核对比度阈值、最小核强度、核分割激进程度以及核大小设置。

对多个样本重复此过程。在采集了足够数量的图像并相应调整了实时调谐后，从设置操作下拉菜单中保存分析设置。选择所有待分析的图像，然后点击分析。

选择刚刚保存的分析设置，在分析区域窗口中勾选注释层复选框，然后勾选第一层并点击分析。完成后，通过选择导出对象分析数据的选项，导出所有切片的汇总分析数据。该数据集可用于研究细胞大小在毒素或治疗作用下的变化。

腺相关病毒（AAV）注射六周后，通过立体定位注射表达突变型A53T α-突触核蛋白的AAV至大鼠脑黑质，导致多巴胺能神经元密度显著降低。与注射AAV空载体的大鼠相比，注射AAV-A53T的大鼠黑质中每平方毫米酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元的平均数量显著减少。采用无偏立体学方法也获得了类似观察结果。

在尝试本实验方案时，请注意软件的功能取决于其训练程度。因此，必须投入足够的时间和精力，确保单个细胞被准确识别为单个细胞。该软件可进行调整，用于检测其他目的蛋白（如α-突触核蛋白）的荧光强度，以判断特定处理是否能够调节蛋白表达水平。

该技术在测试多种潜在治疗手段对多巴胺能神经元密度的影响时，显著提高了实验效率。