基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法
2021年3月14日
本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.
该方法利用荧光技术检测蛋白质是否在合成膜之间转移生物学上重要的脂质，从而揭示这些脂质在真核细胞内的分布机制。该技术可实现对蛋白质提取和转运天然脂质过程的研究，仅需使用易于制备的荧光细胞和脂质体。该方法可用于研究蛋白质在细胞器与膜之间分配某些必需脂质的生物学过程，并可进行修改以深入探究相关细胞生物学机制。
通过荧光法实时测量脂质转移过程的操作步骤，需要借助直观的视觉演示才能有效阐明。因此，本实验操作将由本实验室工程师 Maud Magdeleine 进行示范。首先配制新鲜的 HEPES 钾盐缓冲液，经滤膜过滤并脱气处理，再加入一毫摩尔氯化镁，制成 HKM 缓冲液。
然后，制备仅由PC组成的脂质体，或额外掺入2摩尔百分比的PS或PI(4)P的脂质体。接着，将烧瓶置于旋转蒸发仪上，在真空条件下干燥脂质。在一个孔中，将含有2摩尔百分比PS的脂质体与脂质传感器NBD-C2 Lact混合，终浓度为250纳摩尔，终体积为100微升。
用相同量的脂质体和NBD-C2乳剂混合物填充第二个孔，并加入3微摩尔的脂质转移蛋白（LTP）；用250纳摩尔的NBD-C2乳剂与纯80微摩尔的PC脂质体混合填充第三个孔，第四个孔则仅加入纯80微摩尔的PC脂质体。重复上述步骤，再制备三组各四个孔的样品。
然后将多孔板放入荧光读板仪中。在25°C条件下，于490纳米激发光下，对每个孔采集505至650纳米波长范围内的NBD荧光光谱，激发带宽为5纳米。对于每组实验，用其他样品的光谱减去仅含脂质体的对照孔所记录的光谱。
对于 PI(4)P 提取实验，制备掺入2摩尔百分比磷脂酰肌醇-4-磷酸的脂质体，并使用 NBD-PH FAPP 探针进行检测。进行对照实验并确定提取百分比。完成脂质体挤出后，将挤出的脂质体装入离心管中。
新鲜配制并脱气过滤的 HKM 缓冲液，将含有挤出脂质体的试管置于室温下保存。对于含有罗丹明标记的磷脂酰乙醇胺的脂质体试管，需用铝箔包裹，并存放于不透明盒子中，以防止光漂白。将温度设定在 25 至 37 摄氏度之间，激发单色器调节至 460 纳米（带宽较窄，为 1 至 3 纳米），发射波长设为 530 纳米（带宽较宽，大于 10 纳米）。
将采集时间设置为二十五分钟，时间分辨率不超过一秒。在石英比色皿中，稀释30微升LA脂质体悬浮液和NBD-C₂-lact储备溶液，并预热HKM缓冲液，制备终体积为570微升的样品，其中包含200微摩尔总脂质和250纳摩尔NBD-C₂-lact。加入一根小型磁力搅拌子，将比色皿置于荧光仪样品槽中。
待样品达到热平衡后，启动测量。一分钟后，向样品中加入30微升LB脂质体悬浮液。三分钟后，加入LTP，使LTP的终浓度为200纳摩尔，随后继续采集剩余21分钟的信号。
进行平行实验以标准化NBD信号。将30微升LA平衡脂质体悬浮液与250纳摩尔NBD-C2 lact在HKM缓冲液中混合，终体积为570微升。一分钟后，注入30微升LB平衡脂质体悬浮液。
将使用目标LTP测得的动力学曲线转换为随时间从LA脂质体转移到LB脂质体的PS量。然后对曲线中的每个数据点进行归一化处理。使用与PS转移实验相同的底物发射体设置和条件进行PI(4)P实验。
在比色皿中，加入30微升lb脂质体悬浮液和NBD-PH FAPP探针，并用预热的HKM缓冲液定容至终体积570微升。待样品温度平衡后，开始测定。一分钟后，注入30微升LA脂质体悬浮液。
三分钟后，注入感兴趣的LTP并记录信号。进行第二次实验以标准化NBD信号。将30微升lb平衡脂质体悬浮液与250纳摩尔NBD-PH FAPP及570微升HKM缓冲液混合。
一分钟后，注入 30 微升 LA 平衡脂质体悬液。转换动力学曲线以确定 PI(4)P 随时间从 LB 转移至 LA 脂质体的量，然后对每个数据点进行归一化处理，以量化 LTP 的效率程度。
对转移动力学的初始数据点进行线性回归以获得斜率。将斜率值除以反应混合物中 LTP 的浓度，以确定每单位时间内每个蛋白质转移的脂质分子数。通过 SDS-PAGE 分析验证了从磁珠中有效回收 C2 乳酸。
用NBD标记的C2乳蛋白的紫外-可见吸收光谱证实，所有C2乳蛋白分子均被NBD基团标记。通过SDS-PAGE分析确定了NBD-C2乳蛋白的纯度及其荧光特性。当仅使用含有PS或PI(4)P的脂质体进行孵育时，NBD-C2乳蛋白或NBD-PH FAPP的荧光信号最强，表明该传感器与膜结合。
当同时存在 Osh6p 时，观察到荧光较低，表明该蛋白能有效从脂质体中提取磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）。图中显示了以 Osh6p 作为脂质转运蛋白（LTP）进行的 PS 转运实验结果。计算了 PS 从 LA 脂质体向 LB 脂质体转移的平均动力学曲线，LB 脂质体中掺入或未掺入磷脂酰肌醇-4-磷酸。
平均初始PS转运速率由三个不同的实验确定。同样，此处展示了使用Osh6p作为脂质转移蛋白的PI(4)P转移实验的结果，以及信号归一化后获得的平均动力学曲线。
使用掺入或未掺入PS的LA脂质体测量了平均转移速率。执行本方案时，请使用新鲜缓冲液并于同一天进行制备。尽量减少荧光脂质体和蛋白质的光照暴露，使用纯度良好的NBD标记蛋白，并将其置于冰上保存。可通过利用基因编码的荧光脂质传感器测量原核细胞内细胞器之间PS和PI(4)P的转移来验证。
该技术为进一步理解PS和PI(4)在细胞内的分布情况，以及多种LTPS的活性特异性提供了途径。
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概述
本文介绍了基于荧光的实验方案，用于研究脂质转运蛋白（LTPs）对磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）的提取与转运过程，重点聚焦于酵母蛋白Osh6p。该方法利用荧光标记的脂质探针，实时监测人工膜之间脂质的转移，从而揭示真核细胞中脂质分布的潜在机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 脂质生物化学
- 膜生物学
背景
- 氧化固醇结合蛋白（oxysterol-binding protein, OSBP）相关蛋白（ORPs/Osh）是一类参与细胞内脂质分布的脂质转运蛋白家族。
- 磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）是细胞信号转导和膜特性维持的关键脂质。
- 近期研究发现，ORPs/Osh蛋白介导内质网（ER）与质膜（PM）之间的PS与PI(4)P交换过程。
- 基于荧光的检测方法使得在体外对这些脂质转运过程进行深入研究成为可能。
研究目的
- 开发并演示利用荧光技术测量脂质转运蛋白提取和转移磷脂酰丝氨酸（PS）及磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）的实验方案。
- 表征Osh6p在合成膜之间转移PS和PI(4)P的活性。
- 提供一种可重复的定量脂质转运动力学的方法。
使用的方法
- 高纯度荧光标记脂质探针的制备：NBD-C2Lact（用于磷脂酰丝氨酸 PS）和 NBD-PHFAPP（用于磷脂酰肌醇-4-磷酸 PI(4)P）。
- 制备具有明确脂质组分（PC、PS、PI(4)P）的人工脂质体。
- 采用荧光微孔板读板仪检测脂质转运蛋白（LTPs）介导的脂质提取。
- 利用常规荧光分光光度计进行荧光共振能量转移（FRET）和动力学测量，以定量脂质转移速率。
主要结果
- 带有 NBD 标记的传感器可特异性结合含有目标脂质（PS 或 PI(4)P）的脂质体，从而产生最大荧光信号。
- Osh6p 的存在导致荧光减弱，表明 PS 或 PI(4)P 从脂质体中被有效提取。
- 动力学实验揭示了脂质在脂质体群体间转移的速率，并对转移效率进行归一化与定量分析。
- 对初始动力学数据进行线性回归分析，可计算单位时间内每个蛋白分子转移的脂质分子数量。
结论
- 所述基于荧光的实验方案可精确测量脂质转运蛋白介导的脂质提取与转移过程。
- Osh6p 能有效介导人工膜之间磷脂酰丝氨酸（PS）与磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）的转移，支持其在细胞内脂质分布中的作用。
- 这些方法可被拓展用于研究其他脂质转运蛋白及脂质种类，推动对膜脂动态调控机制的理解。
常见问题
执行层面的行业相关性
基于荧光的脂质转移蛋白（LTPs）介导的磷脂酰丝氨酸（PS）与磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）交换定量分析，填补了膜脂转运机制研究中去风险化评估的关键空白。该技术可实现对脂质转运蛋白的精确定靶验证与功能解析，为早期发现及转化研究提供可预测的信心支持。该方法在影响疾病相关通路和治疗假设的膜脂动态调控相关的项目决策中具有直接应用价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接测量由LTP介导的脂质提取与转移过程，从而阐明转运蛋白的功能。
- 通过量化特定膜之间磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇-4-磷酸[PI(4)P]的转运，支持作用机制层面的风险评估。
- 有助于对参与脂质稳态与信号传导的蛋白质进行功能性靶点验证。
- 提供定量数据，用于评估预测可信度并对转运蛋白靶点进行优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 利用人工膜提供标准化、可重复的LTP活性荧光检测方法。
- 生成适用于化合物或蛋白质比较评估的定量动力学数据。
- 支持多种LTP及脂质种类的检测可扩展性与平台重复使用。
- 制备经过验证的系统，用于下游调节剂或抑制剂的筛选。
转化与临床前研究
- 与疾病相关系统一致，在这些系统中，膜脂分布影响细胞信号传导。
- 支持从发现到脂质转运机制临床前验证的连续性研究。
- 为靶向转运蛋白项目的推进决策提供经风险调整的数据。
- 支持开展有助于转化生物标志物策略的机制性研究。
流程与工作流整合
该基于荧光的实验方案涵盖了从早期发现到先导物鉴定的全过程，既支持对脂质转移活性的假设验证，也适用于其定量筛选。
- 发现生物学：定量分析LTP介导的脂质交换，阐明转运蛋白在膜生物学中的作用。
- 筛选：提供可重复、定量的检测读数，用于检测方法开发和化合物特征分析。
- 分析：提供动力学测量和标准化转移速率，实现可靠的数据比较。
- 转化研究：在模型系统支持下，将脂质转移的机制与疾病相关的细胞过程相联系。
- 企业级复用：提供模块化、可适应的平台，用于研究多种LTP及脂质相互作用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高脂质转运蛋白研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化基于荧光的检测方法，实现不同团队间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提供定量的转运蛋白活性数据，支持决策推进或终止项目，并指导资金分配。
- 项目组合影响：实现对转运蛋白靶点及脂质通路项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备荧光分析设计和脂质生物化学方面的专业知识。
- 需要配备荧光微孔板读数仪和标准荧光计，以进行动力学测量。
- 要求各研究团队在脂质体的制备和传感器标记方面进行严格统一的标准化操作。
- 根据探针的兼容性，可能需要针对不同的脂质转运蛋白（LTPs）或脂质种类进行方法调整。
- 为获得可靠结果，必须严格控制缓冲液的新鲜度、光照暴露以及样品纯度。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Measurement of PS or PI(4)P Extraction
2:44
Real-time Measurement of PS Transport
4:54
Real-time Measurement of PI(4)P Transport
6:23
Results: Membrane-Exchange of Phosphatidylserine/ Phosphatidylinositol 4-Phosphate Using Fluorescent Sensors
7:58
Conclusion
