利用鸡胚作为评估发育性心脏毒性的强大工具

大家好，我是姜其孝，青岛大学公共卫生学院毒理学系副教授。我代表我的研究团队，向大家介绍利用鸡胚进行心脏毒性评估的研究优势。

鸡胚是一种经典的发育生物学模型，具有易于操作、通透性高、封闭的独立系统等多种优势。可利用该模型研究多种环境污染物，例如酚类单宁酸、柴油机尾气，尤其是碳纳米管上的颗粒物。

我们在实验室已建立多种暴露方法，但对于更广泛的原因，功能评估也常规进行。在本视频中，我将向您详细介绍暴露方法以及形态学和功能评估方法。如果您感兴趣，欢迎随时与我们联系。

谢谢。以下是我们的一些暴露方法，我可以向您介绍。现在我要介绍的第一种方法是气室注射，即直接向气室内注射。

用聚碘溶液清洁卵表面。该聚碘溶液为市售产品，用去离子水按1/5比例稀释。然后，用纸巾将蛋壳表面吸干，切勿擦拭。

这一点很重要，因为刷洗会破坏蛋壳外表面的保护层。在暗室中清洗所有鸡蛋，并用铅笔标记气室位置。剔除蛋壳有裂纹的鸡蛋。

同时排除气室位于侧面的卵。若气室呈钝端，则极不可能正常孵化。用75%酒精对气室区域以及金属探针进行消毒。

将其擦干，然后用探针在气室区域的中心钻一个小孔。切勿将探针深入插入气室，只需用探针的尖端刺破蛋壳即可。

如果孔仍然不够大，需在已有孔的附近再次击破蛋壳，直至孔足够大以插入移液器枪头。将移液器枪头插入孔中，使枪头接触内膜。缓慢注入混合液，并保持枪头在原位至少10秒。

这是为了确保分装的油被完全排出。然后移除吸头。现在，用刷子和一滴熔化的石蜡密封孔洞。

注意不要将融化的石蜡滴到内层膜上。密封后，将鸡蛋放入培养箱中，直至达到所需的胚胎发育阶段。第二种方法，我将要介绍的是显微注射法。

首先，需要按照气室注射部分所述的方法对鸡蛋进行清洁和处理。该操作必须在无菌操作台中进行。使用丙酮对气室区域和器械进行消毒。

使用金属探针在气室区域中心钻一个小孔。切勿将探针深入插入气室，以免损坏内层膜。然后，采用相同方法小心扩大孔径，直至直径约为2毫米。

这可以实现对内层膜内存比例的确认。然后将溶液装入微量注射器中，小心地将针头穿过孔洞插入内层膜，深度约为三毫米。轻柔地注入溶液，随后拔出针头。

尽量保持针头垂直。用一小片胶带将孔密封。完全覆盖该孔，以防止在后续孵育过程中胚胎脱水和死亡。

我将介绍的第三种方法是气室灌注法，即将气体污染物注入蛋的气室中。鸡蛋的清洁和处理方法请参照气室注射部分所述步骤进行。

然后可以继续孵育鸡蛋至胚胎发育第17天。在胚胎发育第17天操作鸡蛋，标记气室区域。在胚胎发育第18天，将鸡蛋从培养箱中取出，用丙酮对气室区域和器械进行消毒。

然后小心地在气室的两侧各钻两个小孔，一个用于注入气体或气溶胶，另一个用于排出空气。

精确控制孔的尺寸，使注射孔的侧面刚好能够插入导管针，而扩大的孔直径应稍大一些，约为一毫米。现在这是用于盛放目标气体或气溶胶的样品袋。

可以使用您现有的任何设备进行替代。轻轻将10 mL气体或气溶胶注入注射器中，然后小心地将注射器连接到我们的导管针上，同时将内针撤出，以确保其质地柔软。

将此导管针轻轻插入输液孔中。插入后，对导管针施加压力，以尽量减少注射部位的渗漏。

另一根手指可环绕在排气孔周围以确认输注情况。若轻柔地进行输注，应能轻易感觉到从排气孔流出的气流，这便是气室中的原始空气被排出的现象。

输注完成后，立即封闭两个孔洞。用这些胶带将卵放回孵育箱中。接下来，我将介绍我们的终点评估流程。

使用戊巴比妥（33 mg/kg）进行腹腔注射，完全麻醉动物，通过眼睑反射测试确认麻醉效果。然后将鸡置于手术台上。

用乙醇对腹部区域和电极进行消毒。然后，从腹部两侧皮下连续插入两根针电极。插入时应稍微提起皮肤，确保针头不进入腹腔。

然后从该位置插入针头。插入后，小心地向前推进针头，直至到达胸腔侧面。确保针头不要深入体内，也不要穿出皮肤。

然后使用心电图仪器进行测量。其他能够进行心电图检测的医疗设备也可使用。我们的第二种终点评估方法是绘制莫特林分布图。

这是按照 HME 方式的心脏横截面。这是我们准备进行测量的右心室。为此，我们使用两个标尺。

标尺1和标尺2。现在我们将标尺1复制到屏幕上，调整其至适当大小，然后进行旋转。接着移动标尺，使水平线的两端分别与右心室壁的两个端点对齐。

现在，我们有七条测量线穿过右心室壁的三个区域。接下来，我们也将副标尺复制到图像中，并对其稍作调整，旋转并重新定位，使其放置位置与之前一致。

这条水平线与右心室外壁平行。而垂直线则穿过标尺的白质线与右心室内壁相交的点。然后我们标记测量点，以便后续使用 ImageJ 进行测量。每个样本重复此过程 7 次，以获得具有代表性的右心室测量数据。

我将为您展示当前结果的总结。这是在孵化前向卵内注射PFOA的结果，您可以看到，随着注射剂量的增加，血清中LPF的浓度显著上升。该结果证明了显微注射方法的有效性。

可以看到，A 是对照组，而 B 是注入了具有强荧光信号的抗病毒 q 蛋白的样本。您能够观察到强烈的荧光信号。这证明了上皮灌注的有效性。

可以看出，随着柴油尾气的灌注，心肌组织中观察到了显著的光纤变化。此外，您还可以看到孵化后0、1和2周龄小鸡的R-R间期，在灌注柴油尾气后也发生了显著改变。

这表明您已将此因素纳入考虑，即本方法。在此示例中，您还可以观察到上皮灌注的效果。可以看出，心脏右心室在经柴油机尾气气溶胶灌注后，其功能显著增强。

当然，这里我们还使用了组织形态计量学方法。我们刚刚向您展示了，这种方法非常有效。好的。

以上是我将向您介绍的全部方法。希望这些内容能够促进其他研究人员将鸡胚作为发育毒理学领域中一种强大的研究工具来开展工作。祝您有美好的一天。