人源CRISPR基因编辑CAR-T细胞的制备

我们的实验室方案能够将人类基因组编辑与CAR T细胞治疗相结合。该实验流程采用CRISPR-Cas9技术，可高效靶向多达三个基因。最后，我们的方法可转化为人体临床试验。

所述方法可应用于其他CAR结构和靶基因。该技术的基础具有足够的稳健性，可扩展至更大规模，并可供学术界和工业界合作者进一步开发。首次尝试本方案时，应限制向导RNA筛选中的组数，以确保准确的孵育时间。

根据我们的经验，遵循所述的培养条件和接种密度至关重要。首先，从健康志愿者供体获取自体外周血单个核细胞（PBMC），并使用商业化CD4和CD8分选试剂盒分离CD4阳性与CD8阳性T细胞。将CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞按1:1比例混合，以每毫升300万个细胞的密度在R10培养基中孵育，添加人IL7和人IL15各5纳克/毫升，于37摄氏度过夜培养。

第二天，计数T细胞，并将500万至1000万个细胞在300 × g条件下离心5分钟。弃去所有上清液，用低血清最低必需培养基洗涤细胞沉淀。根据生产商说明书，将沉淀重悬于100微升核转染溶液中。

在洗涤细胞的同时，通过将10微克Cas9核酸酶与5微克单链向导RNA在室温下孵育10分钟，制备核糖核蛋白（RNP）复合物。设置不含单链向导RNA的模拟对照组。将重悬的细胞与RNP复合物混合，并加入4.2微升4微摩尔的电穿孔增强剂。

充分混匀后转移至电穿孔比色皿中。使用脉冲程序EH111对细胞进行电穿孔，随后将5×10⁶个细胞/毫升置于R10培养基中，添加10 ng/mL人IL7和10 ng/mL人IL15，于12孔板中30 °C孵育48小时。孵育结束后，进行T细胞激活与扩增。

通过将PCR扩增子序列输入标准引物设计软件中来设计测序引物。该设计软件将推荐多个适用于Sanger测序的引物序列。选择正向和反向引物时，应确保其结合位点位于gRNA切割位点上游或下游至少150个碱基对处，以保证在插入缺失（indels）区域获得良好的测序质量。

使用 TIDE 分析在基因组水平检测敲除效率。该算法可从测序痕迹中准确重建插入缺失突变谱，并计算 R 平方值。激活后，T 细胞在培养中扩增并冷冻保存，以用于后续研究。

在扩增过程中，对模拟转导和基因编辑的CAR T细胞在整个实验流程中均追踪其群体倍增次数和体积变化。在扩增期间，细胞的增殖和活化未检测到显著变化。细胞冻存后，对模拟编辑和基因敲除的CAR T细胞均检测了CAR表达水平，以用于后续功能研究。

未观察到显著变化。敲除效率可通过多种技术进行测定。在这些具有代表性的流式细胞术图谱中，使用单导向RNA靶向PDCD1和TRAC基因座，结果显示，在多个健康供体中，PDCD1单导向RNA的敲除效率为90%，TRAC单导向RNA的敲除效率为98%。

确保Cas9与向导RNA的摩尔比准确非常重要。在操作过程中，细胞应始终保存在4摄氏度，并避免长时间置于电穿孔溶液中。CAR保存后，经CRISPR编辑的CAR T细胞可用于体外和体内功能检测，例如细胞毒性检测、细胞因子产生检测以及同系或异种移植肿瘤小鼠模型。

我们采用CRISPR Cas9技术的方法目前正应用于临床试验。该方法既可用于癌症治疗，也可用于非恶性遗传性疾病，例如影响全球数百万儿童和成年人的血红蛋白病。