在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫研究中的鼻内免疫与乳汁采集

母体免疫及抗体转移的研究具有多重重要意义，因为这是新生儿和婴儿获得免疫保护、抵御病原体和疾病的第一条途径。由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫的优良模型。在本视频文章中，我们展示了实验室在新西兰白兔母体免疫研究中所采用的技术，包括经鼻免疫和乳汁采集。

我们将首先描述一项在新西兰白兔中进行的黏膜母体免疫研究的示例时间线及事件序列。雌性兔子通过鼻内途径进行免疫，如本视频所示。根据具体研究设计，疫苗可能需要加强免疫，或需通过其他途径给予，例如肌肉注射免疫。

尽管图中未展示，但应在首次免疫前采集血液，用于基线测量，并在后续研究过程中定期采集。通过中央耳动脉，在轻度镇静和局部镇痛剂作用下可轻松获取血液。这些样本可用于检测抗原特异性IgG水平。

随后进行兔子的繁殖。为了确保这些研究具有较高的妊娠率，我们更倾向于从供应商处购买经过验证的种兔用于繁殖。根据免疫时间表的不同，兔子在妊娠期间可能需要接受额外的免疫接种。

抗原特异性的IgG会通过胎盘转移给幼兔。母兔在配种后约30至32天将分娩产仔。我们建议在幼兔出生后的最初几天内尽量减少对其的抓取操作，以降低母兔排斥幼兔的风险。

可从幼崽采集血液样本，以评估经胎盘转移的抗原特异性IgG水平。也可在出生时或出生前后从少量幼崽采集血液样本，以评估早期抗原特异性抗体水平。除了多种营养物质外，幼崽在哺乳期间还可从泌乳母羊获得抗原特异性IgA。

幼崽通常在4至8周龄时断奶。在断奶前，可按照本视频所示方法，从哺乳期母羊中轻松采集乳汁。随后对采集的乳汁样本进行处理，以检测抗原特异性IgA。

根据研究需要，可在幼兔出生后很早的阶段通过外侧隐静脉对其进行疫苗接种和加强免疫，并采集系列血样。接下来，我们将演示新西兰白兔的鼻内免疫接种及乳汁采集方案。所有操作均经杜克大学机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其相关政策执行。

鼻内免疫。所需材料：乙酰丙嗪（Acepromazine）、注射器和针头、眼用润滑剂、异氟烷（Isoflurane）、鼻罩、移液器及移液器吸头、黏膜疫苗。在处理动物前配制免疫溶液。

使用乙酰丙嗪按每公斤体重1毫克的剂量进行肌肉注射使兔子镇静，并通过鼻罩使用异氟烷进行麻醉。当通过眼睑反射评估确认兔子已完全麻醉后，向每只眼睛滴加眼科润滑剂，以防止眼睛干燥及继发性角膜溃疡。当实验室人员准备接种疫苗且兔子已达到适当的麻醉深度时，关闭异氟烷和氧气，移除鼻罩。

将兔子置于仰卧位，将其颈部和头部支撑在约45度角的位置，以便实验人员能够方便地接触并清晰观察两侧鼻翼。用移液器吸取不超过100 µL的疫苗溶液，迅速将溶液滴入一侧鼻孔，然后重复操作滴入另一侧鼻孔。移液器应保持约45度角。

将针头朝向鼻腔内侧。免疫接种的目的是使溶液接触到鼻孔的黏膜组织，因此针头不应插入鼻孔内部，以免造成黏膜组织的擦伤或刺激，并可能影响经鼻接种疫苗的免疫原性。

疫苗应快速接种，并以相同方式接种另一侧鼻孔。两侧鼻腔接种完成后，将兔子保持仰卧位30秒，以尽量减少疫苗溶液外漏。实验室通常每次每侧鼻孔接种量不超过100 µL。

若需给予较大体积的疫苗，且总体积最大为500微升，可将疫苗分为每份100微升的等分试样，每次免疫之间间隔30秒。随后重复给予额外剂量的疫苗，每次给药之间保持30秒的休息间隔，直至完成全部疫苗体积的接种。免疫后，将兔子置于腹部体位以促进恢复，并密切监测动物状态，直至其能够维持胸骨卧位。

在某些情况下，疫苗制剂可能未完全递送至鼻腔，部分疫苗制剂可能残留在鼻孔外部。此时，由于无法明确已准确递送至鼻腔的疫苗体积，不建议重新施用额外的疫苗材料，因为这会为实验引入一个未定义的变量。重要的是采用一种能够将疫苗制剂完整且一致地递送至鼻腔的疫苗递送技术。

乳汁采集。所需材料：乙酰丙嗪、注射器和针头、酒精棉片、纱布、眼科润滑剂、异氟烷、鼻罩、催产素和采集管。通过肌肉注射每公斤1毫克乙酰丙嗪对家兔进行镇静，并使用鼻罩给予异氟烷进行麻醉。

通过眼睑反射评估确认完全麻醉后，向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥及继发性角膜溃疡。使用酒精棉片清洁耳缘静脉部位的皮肤。采用1毫升注射器和25号针头，通过耳缘静脉注射约1至2个国际单位的催产素，以诱导泌乳。

由于平滑肌松弛，给予催产素后兔子常会出现排尿或排便现象。注射催产素后，用一块纱布按压注射部位以达到止血目的。在保持麻醉面罩或鼻罩覆盖兔子鼻部的同时，将兔子后肢抬起，使其臀部垫高。

顺便提一下，采集乳汁时也可使动物处于侧卧位，但本实验室发现，当由助手扶住兔子使其臀部着地直立，并用麻醉面罩固定时，采集乳汁更为方便。打开无菌管以准备采集乳汁，找到乳腺组织及相关乳头。兔子通常有四到五对乳腺。

乳头周围通常因近期哺乳而有湿润的毛发，且当充满乳汁时，乳腺组织容易触及。用拇指和食指夹住与乳头相连的乳腺组织，沿乳头方向对腺体组织施加轻柔的按摩压力。将收集管置于乳头上，以收集挤出的乳汁。

催产素有时需要数分钟才能起效，且不同乳腺的泌乳量可能存在差异。若挤奶不成功，可等待数分钟，或换至另一乳腺继续尝试。所有乳头采集的乳汁可收集于同一管中。

通常可以从泌乳期的母羊中轻松收集到数毫升的乳汁。收集到所需体积的乳汁后，关闭异氟烷和氧气，移除兔子的鼻罩，并在密切监测下让兔子恢复，直至动物能够维持胸卧姿势。代表性结果。

图一。在母体研究中，尽早确定妊娠状态有助于确认母羊是否需要重新配种。妊娠检测的方法包括触诊、超声检查、X光成像、体重增加监测，以及分子技术，如胰岛素样生长因子和孕酮的检测。

足够的孕酮水平对于维持兔子的妊娠至关重要。因此，多项研究也评估了妊娠兔的孕酮水平，并证明与非妊娠兔相比，妊娠兔的孕酮水平升高，尤其是在妊娠中期器官形成阶段更为显著。如图一所示，即使已确认所有母兔均与公兔交配成功，仍可在妊娠兔中检测到较非妊娠兔更高的孕酮水平。

使用全自动化学发光法检测血清孕酮水平。图二。通过胎盘在妊娠期间转移的抗原特异性IgG可在子代血清中通过ELISA进行检测。

可在出生时或出生前后，从少量仔兔体内采集血液，以评估早期抗原特异性抗体水平。随着仔兔年龄增长、体型增大，连续采血在技术上要容易得多。如图二所示，可测定仔兔体内抗原特异性IgG的血清水平，并与母体水平进行比较。

出生时母体传递的IgG水平较高，随后随时间推移逐渐下降。图三。兔奶可按本视频所示方法采集，并通过ELISA检测总抗体及抗原特异性抗体水平。

如图所示，IgA 占乳腺乳汁中可被动转移给幼崽的总抗体的很大一部分。IgA 和 IgG 水平均显著高于 IgM。摘要：本视频文章介绍并演示了鼻内疫苗的接种以及从哺乳期兔子中采集乳汁的方法，以此作为在母体免疫的转化性适宜模型中评估黏膜免疫的手段。

图示为一项典型的母体鼻内免疫研究设计的汇总图，包括免疫接种、交配、分娩、哺乳及抗体传递等环节。