利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

这些研究旨在提供稳定且可重复的模型系统，用于开展肠道上皮的特定方向性研究。顶侧类器官可大量生成，有望用于高通量筛选。单层培养物更易于操作，并可同时接触顶侧和基底侧表面。

在开始倒置操作前，确保类器官的直径在150至250微米之间。小心移除并弃去每个含有类器官的孔中的培养基，注意不要破坏ECM凝胶 dome 结构。向每孔加入1毫升冰上预冷的解离溶液，于室温孵育1分钟。

使用包被过的枪头缓慢吹打，小心地将类器官球体从基质中分离，注意避免破坏或碎片化类器官。将类器官悬液转移至经抗黏附溶液处理过的培养板中，并将培养板置于4°C条件下，在摇床上孵育30分钟。30分钟后取出培养板，使用经抗黏附溶液包被的1毫升枪头，轻轻上下吹打溶液。

将培养板置于4°C摇床中继续孵育30分钟。取出培养板，在室温下静置1至2分钟，使类器官依靠重力自然沉降。待类器官沉降后，尽可能吸除消化液，并加入1.5毫升DMEM F-12洗涤。

让类器官沉降后移除上清液，然后重复洗涤一次。尽可能去除DMEM F-12，并加入0.5毫升肠道类器官扩增培养基。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，通过将培养板倾斜25至30度角，并沿孔壁小心移除培养基以进行部分换液，注意避免移除悬浮的类器官。加入0.4毫升肠道类器官扩增培养基，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下继续孵育三天。

若已形成聚集体，使用经抗黏附溶液包被的1毫升移液枪头，将枪头末端抵住培养板底部，反复吹打20次以剪切聚集体。加入1毫升预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液重悬类器官，并充分混匀以确保形成均匀悬浮液。

对于细胞数量较多或存在大量细胞外基质（ECM）的情况，可额外加入最多一毫升的胰蛋白酶-EDTA。在37°C下孵育5至10分钟，然后用1毫升移液器充分混匀，以破坏类器官结构，使其完全解离为单个细胞或小片段。若需进一步完全解离片段或完整的类器官，可继续在37°C下用胰蛋白酶-EDTA孵育3至5分钟。

当类器官充分解离后，加入等体积的DMEM F-12，上下吹打混匀。通过向细胞中加入10% FBS以灭活胰蛋白酶-EDTA。将组织片段在2至8摄氏度下以200 × g离心五分钟。

如果解离后的类器官未能形成沉淀，需通过反复吹打充分混匀细胞，然后再次离心。小心尽可能去除上清液，仅保留细胞沉淀。

将每孔待接种的细胞重悬于 100 微升肠道类器官分化培养基中。根据孔径大小适当调整体积。从培养箱中取出包被好的培养板，并吸除每孔中多余的基底膜基质溶液。

向每个细胞培养小室的上室加入100微升细胞悬液，向其下室加入500微升肠道类器官分化培养基。然后在37°C和5%二氧化碳条件下孵育。每两到三天更换上室和下室中的培养基。

建立气液界面（ALI）培养时，需移除上室和下室中的培养基，并向下室加入新鲜的肠道类器官分化培养基，上室则保持为空。使用肠道类器官扩增培养基培养的肠道类器官呈现囊状形态。当去除细胞外基质（ECM）后，部分类器官在前3天内倾向于发生聚集，需进行剪切处理以增加类器官数量。

在细胞外基质（ECM）中培养的肠类器官持续扩张，并自发形成次级出芽结构。在缺乏细胞外基质的情况下维持培养五天的类器官则呈现拉长、囊状且不规则的形态。在暴露于培养基的上皮外侧检测到非典型标志物（如villin和ZO-1）的表达。

经细胞核、绒毛蛋白（villin）和ZO-1染色的细胞外基质包埋类器官，显示出发育良好的顶-基底极性，其中顶侧朝向类器官腔内。单层细胞形成后，细胞间建立了紧密连接，并形成融合的细胞层。该融合层还将含绒毛蛋白的刷状缘定向至上皮的顶侧，并在细胞间形成ZO-1多蛋白复合物。

向气液界面（ALI）培养体系的转换可诱导进一步分化，杯状细胞更加明显，可通过分泌型黏蛋白 MUC2 的染色观察到。为诱导极性翻转，关键在于彻底去除所有细胞外基质（ECM），同时不破坏或使类器官碎裂。更换培养基时也需谨慎操作，以避免移除任何悬浮的类器官。确保存在足够数量的单细胞，是建立高质量单层培养体系的主要决定因素。

现在可以在符合研究人员需求的相关系统中研究顶端特异性功能，例如营养吸收或宿主与病原体的相互作用。