使用荧光染料罗丹明B研究雄性交配竞争力 埃及伊蚊 蚊子

本方案用于评估雄性蚊子的交配竞争能力，这是基于释放雄蚊的蚊群抑制计划的前提条件。该适应性指标被用于质量控制和品系评价。本方法可将实验时间缩短90%，并允许直接比较两种不育或感染沃尔巴克氏体（Wolbachia）品系之间的交配竞争能力。

本实验操作将由 Irene Li 和 Keng Wai Mak 完成。首先，根据蛹期大小差异对雄性和雌性蚊子进行性别分离。对于每组蚊子，将 100 个雄性蛹转移至预先标记好的笼子中，用于蔗糖喂养或罗丹明 B 蔗糖喂养。

将雌性蛹以每笼40至50只的小批量放入笼中。成虫羽化后，检查笼内是否存在雄性蚊子。配制0.2%罗丹明B蔗糖溶液时，每100毫升10%蔗糖溶液中加入200毫克罗丹明B粉末并溶解。

充分混匀以确保所有粉末完全溶解。准备20个带灯芯的糖饲瓶。向其中10个饲瓶中各加入10毫升10%蔗糖溶液，向另外10个饲瓶中各加入10毫升0.2%罗丹明B蔗糖溶液。

在每个准备好的雄性蚊虫笼中放入五个饲喂瓶，让雄性蚊虫在交配实验前取食三天。打开汞灯和体视显微镜，让汞灯光源稳定10分钟。

然后为红色荧光蛋白一设置荧光滤光片。每次用口吸器的玻璃管吸取少量蚊虫。通过玻璃管，在荧光体视显微镜下观察雄蚊的虫体。

实验中仅使用经罗丹明B标记的雄性蚊子。将A组雄性蚊子转移至12个用网罩固定的纸杯中。在其中六个纸杯中，每杯放入10只饲喂过蔗糖的雄性蚊子；在另外六个纸杯中，每杯放入10只饲喂过含罗丹明B蔗糖的雄性蚊子。

对B组雄性蚊子重复此步骤。设置12个笼子用于交配实验。在其中的六个笼子中，各放入10只用罗丹明B标记的A组雄性蚊子、10只未标记的B组雄性蚊子以及10只未交配的野生型雌性蚊子。

在其余六个笼子中，分别放入10只无标记的A组雄蚊、10只用罗丹明B标记的B组雄蚊和10只未交配的野生型雌蚊。对这些笼子进行标记，以明确区分两种交配组合。根据标签将相应雄蚊杯放入对应的交配笼中。

取下网罩，轻轻敲击杯子，使雄蚊从杯中脱落。小心地将纸杯和网罩从笼中移除，确保没有蚊子逃出。让雄蚊在交配笼中适应至少一小时。

使用口吸器将未交配的野生型雌蚊转移至12个纸杯中，每杯放入10只蚊虫。在雄蚊适应环境后，将每杯雌蚊分别放入一个交配笼中，并移除网罩。轻轻晃动纸杯，促使残留的雌蚊离开纸杯，然后小心地将纸杯和网罩从笼中取出，确保无蚊虫逃逸。

让蚊虫交配持续三小时，然后使用机械吸蚊器将每只笼子中的所有蚊虫移除，以终止交配实验。将蚊虫置于冰上冷麻醉至少五分钟。当蚊虫完全麻醉后，轻柔地挑出雌性蚊虫，并将其饲养于用纱网封口的独立纸杯中。

通过将交配笼上的相应标签转移至纸杯，对纸杯进行标记。为检测雌蚊的受精囊，需先将雌蚊置于冰上低温麻醉至少五分钟，随后在体视显微镜下进行解剖。在体视显微镜下解剖雌蚊。

在显微镜下检查受精囊。如果雌性未受精，则三个受精囊均为空；如果已受精，则两个或三个受精囊中会充满活动的精子。对于已受精的个体，使用配备RFP1滤光片的荧光体视显微镜观察受精囊，以确定其中是否含有Rhodamine B标记的精液。

如果受精囊中充满未用罗丹明B标记的精液，则不会观察到荧光。相反，如果受精囊中含有用罗丹明B标记的精液，则会发出橙色荧光。本交配竞争能力检测的目的是确定经过多代近交后，雄性个体的交配适合度是否可能下降。

进行了交配竞争能力实验的三个重复实验，此处展示了授精数据。野生型雌性分别与近交系或远交系雄性交配，并进行了相应的罗丹明B标记。结果显示，近交系或远交系雄性授精的雌性比例未受到罗丹明B标记的影响。

在全部三个重复实验中，与近交雄性相比，与远交雄性交配的雌性比例显著更高，表明近交可能导致交配适合度的下降。务必准备额外的雌蚊笼子。切勿使用已被雄蚊污染过的笼子中的雌蚊，因为预先交配过的雌蚊会使所有数据无效。

除了基于实验室的交配竞争能力测定外，该方法还可用于标记-释放-重捕实验，以研究昆虫的交配生物学、种群动态及其扩散能力。