一种从人多能干细胞生成肾类器官的简化方法

该方法可在任何具备细胞培养实验条件的实验室中进行。通过此方法，我们能够进一步了解肾脏发育及疾病通路。与其他生成肾类器官的方法相比，该方法相对简单且成本较低。

该技术最大的挑战在于维持高质量的人类多能干细胞培养。必须将细胞维持在低于80%的融合度，并定期进行传代。刚接触人类多能干细胞培养的研究人员应在进行分化实验前，先熟悉所使用的干细胞系。

开始肾类器官实验，向每个六孔超低吸附培养板的孔中加入两毫升完全E5-ILP培养基。将人多能干细胞（hPSCs）在100毫米组织培养处理过的培养皿中培养至60%融合度。用约八毫升DPBS洗涤hPSCs两次。

吸除 DPBS，然后逐滴加入 2 毫升 Dispase 以覆盖细胞，在 37 摄氏度下孵育 6 分钟。用约 10 毫升 DPBS 洗涤细胞 3 次。吸除 DPBS，将培养板倾斜 45 度，用细胞刮棒刮下细胞。

用10毫升血清移液管将6毫升完全E5-ILP培养基沿培养板顶部加入，冲洗下菌落。然后，保持移液管垂直，通过轻柔吹打上下重悬液体以分散大块菌落，注意避免触碰培养板壁。将菌落团块均匀分配至6孔板中，每孔加入1毫升，随后将6孔板置于37摄氏度培养箱内的轨道摇床上。

或者，若无轨道摇床，也可进行静态培养。在第二天，待类胚体沉降至培养板底部后，将培养板倾斜45度，从上部缓慢吸出培养基，每孔保留1毫升。每孔加入2毫升预先配制的完全培养基，然后将培养板放回摇床继续培养。

第三天，吸取并移除培养基后（操作方法如前所述），使用10毫升血清移液管小心地从每个孔中收集所有类胚体，并转移至一个50毫升锥形管中。为收集残留的类胚体，用1毫升低糖DMEM冲洗每个孔，并将冲洗液加入同一50毫升锥形管中。在等待类胚体沉降至管底的过程中，向六孔板的每孔中加入2毫升第二阶段培养基。

接下来，将一个200微米的细胞筛置于新的50毫升锥形管上，小心地将所有类胚体通过移液转移至细胞筛上，以滤除较大的类胚体。用额外的5毫升DMEM冲洗细胞筛，以收集滞留在筛网中的任何类胚体。在后续阶段，先使用500微米的细胞筛滤除过大的类胚体，然后将滤液通过200微米的细胞筛，以去除不含管状结构的过小类胚体。

通过将200微米滤网倒置至新的50毫升离心管中，并用DPBS冲洗滤网，收集大小在200至500微米之间的正确尺寸的类胚体。过滤后，让类胚体沉降至锥形管底部，然后吸除上清液，并用约10毫升DMEM洗涤。随后，将类胚体重悬于6毫升第二阶段培养基中。

将类胚体重新转移至六孔超低吸附培养板中，均匀分配至各孔。由于大多数类器官会聚集在移液管顶部，因此在转移结束时需保留约0.5毫升液体，然后轻轻将枪头接触每孔中的培养基，使类器官缓慢流入孔内。将类胚体转移至含有45毫升第二阶段培养基的125毫升旋转培养瓶中。

将磁力搅拌速度设置为 120 rpm，然后将烧瓶放入培养箱中。喂养胚状体或肾类器官时，先让其短暂沉降至旋转烧瓶底部，然后从烧瓶一侧臂处掀开盖子，将吸液移液管插入瓶内，管尖轻触对侧内壁。缓慢倾斜移液管向下，吸出约一半的培养基。

通过同一开口，用移液管加入 20 毫升新鲜的 II 期培养基。使用长柄无菌镊子，小心地将一个磁力搅拌子放入每孔含有胚状体或肾类器官的六孔板的每个孔中。将六孔板置于六孔磁力搅拌台上，设置转速为 120 rpm。

为使磁力搅拌子迅速就位并开始旋转，首先将功率调至100。待所有搅拌子开始旋转后，将功率降至25。通过更换一半培养基的方式维持肾类器官的培养，操作方法如前所述。

第14天肾类器官石蜡切片的免疫荧光结果显示存在肾单位节段，例如表达肝细胞核因子-1β和莲藕四棱豆凝集素的肾小管，以及表达V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物B和足蛋白的足细胞簇。本方案中的改进可支持内皮细胞的扩增，培养第26天通过血小板和内皮细胞黏附分子-1染色已证实该结果。人类多能干细胞需要用Dispase处理适当时间，然后彻底洗涤以去除所有残留。

如果未完全去除中性蛋白酶（Dispase），可能导致细胞死亡以及类胚体聚集。该方法有助于我们在体外研究先天性肾脏疾病的发育过程，以及多种肾脏损伤通路和潜在的治疗干预手段。