斑马鱼非酒精性脂肪性肝病相关肝细胞癌早期进展过程中肝脏微环境分析

我们的斑马鱼肝癌模型及实验方案提供了一个独特的机会，可利用活体显微成像技术非侵入性地在活体中可视化肝脏微环境及免疫格局。斑马鱼幼体的透明性无疑是该系统的主要优势，使我们能够进行非侵入性的活体显微观察，深入了解肝脏等深层组织和器官的微环境以及免疫细胞的浸润情况。本方案中所述的饮食诱导肾病模型及成像技术可轻松应用于其他肝脏疾病或研究领域中复杂的细胞间相互作用，包括代谢综合征和心血管疾病。

进行该实验操作的是我们的实验室技术员 Cassia Michael，以及我实验室的博士后研究员 Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro。首先，将四克商品化斑马鱼幼鱼干饲料分别称量至两个 25 毫升的玻璃烧杯中，其中一个用于正常饮食组，另一个用于 10% 高胆固醇饮食组（HCD）。再称取 0.4 克胆固醇至一个 10 毫升的玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖烧杯。

在通风橱中，使用带20号针头的10毫升注射器量取5毫升乙醚。然后将乙醚加入正常饮食烧杯中，并立即用刮勺与干燥食物混合。使用同一注射器和针头再量取5毫升乙醚，加入含HCD的烧杯中。

立即用注射器反复抽吸以充分混匀。迅速将胆固醇溶液加入HCD烧杯中，并立即用刮刀搅拌至溶液均匀。将烧杯置于通风橱中静置最多24小时，以使乙醚完全蒸发。

第二天，使用研钵和研杵将饲料研磨成细小颗粒。将每种饲料转移至已标记的小型塑料袋或50毫升离心管中，并于-20 °C条件下保存。在实验开始前一日建立转基因鱼系。

在第0天，鱼类产卵后，使用网筛收集卵。用装有E3培养基的洗瓶彻底冲洗卵，并小心地将其转移至含有E3培养基的10厘米培养皿中。清除繁殖盒中可能积聚的所有碎片，包括任何死亡或未受精的卵，以防止微生物不受控制地生长，从而避免导致幼虫发育异常。

然后将卵以每皿70至80枚的密度分配至含有25毫升E3培养液的培养皿中。第一天，在配备透射光源底座的解剖显微镜下检查并清除死亡的胚胎或具有发育缺陷的胚胎。第五天，将所有培养皿中的幼鱼收集至一个15厘米的培养皿中，并加入不含亚甲蓝的E3培养液。将幼鱼分至饲养盒中，并按照文稿中所述方法进行喂养。

将幼鱼置于28摄氏度的斑马鱼饲养室或培养箱中，在明暗循环条件下饲养，并从第5天至第12天每天喂食两次。每天使用连接1毫升移液器吸头的真空系统清除食物残渣以及90%至95%的培养液。然后，小心地将不含亚甲蓝的新E3培养基倒入饲养盒的一角，以避免损伤幼鱼。

或者，可将幼虫分装至装有系统用水的三升水箱中，并作为独立的系统单元放置，保持较低的水流速度。此替代方案可节省每日清洁所需的时间，且过滤系统有助于在实验终点前维持幼虫的健康状态。第13天时，根据所设置的实验条件数量准备相应的收集皿。

倒入足量不含亚甲蓝的E3培养液，以覆盖每个培养皿的底部。然后，使用真空系统小心抽吸喂养盒中的水。当水位开始降低时，缓慢抬起喂养盒，使幼鱼游向其中一个角落，随后从相反方向进行抽吸。

当液体剩余约 20 至 30 毫升时，小心地将幼虫倾倒入已准备好的收集培养皿中，并将取自饲养盒的标签胶带贴在培养皿盖上。在荧光体视显微镜下，筛选麻醉后的幼虫以确认所需的荧光标记。然后向损伤与捕获装置的腔室中加入三卡因 E3。

使用 P-200 微量移液器去除腔室和限制通道中的气泡。移除所有多余的三卡因 E3 溶液，仅保留足以充满腔室的液体体积。接着，将一条麻醉后的幼鱼转移至损伤与捕获装置的加载腔室中，并使用睫毛工具将其定位，以便对左叶进行成像。

按照文本稿件中的描述，在共聚焦显微镜下观察肝脏中所有所需细胞的形态。打开 Fiji 软件，然后打开图像文件，并在 Bio-Format 导入选项选项卡中勾选“拆分通道”选项。

对每个通道创建最大强度投影后，绘制围绕幼鱼肝脏的感兴趣区域（ROI），并测量肝脏面积。随后添加比例尺作为参考，并创建第二个ROI，包含肝脏区域及周围75微米的范围。在“插件”（Plugins）菜单中，选择“分析”（Analyze）选项，接着选择“细胞计数器”（Cell Counter），对招募区域内的免疫细胞进行计数。

在电子表格中记录招募的免疫细胞数量。通过将免疫细胞数量标准化为每单位肝脏面积，计算中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞的密度。经油红O染色检测，以正常饮食喂养的肝细胞癌斑马鱼幼鱼未出现肝脂肪变性。

然而，以高胆固醇饮食（HCD）喂养的HCC幼鱼表现出明显的肝脂肪变性增加。在暴露于过量胆固醇八天后，观察到HCC幼鱼出现肝脏肿大。为评估肝肿大，检测了肝脏面积、肝脏表面积和肝脏体积。

在非酒精性脂肪性肝炎相关的肝细胞癌中，肝细胞面积、细胞核面积以及核质比均增加。在高脂饮食喂养的肝细胞癌组中，还观察到细胞核圆形度显著降低。利用H2B-mCherry标记，在饲喂高胆固醇饮食的肝细胞癌幼虫中检测到更高的微核发生率。

肝脏血管评估显示，饲喂高胆固醇饮食（HCD）的肝细胞癌（HCC）幼鱼血管密度显著增加。在HCC幼鱼以及饲喂HCD的HCC幼鱼中均观察到巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。对肝脏及其周围区域巨噬细胞内中性粒细胞的定量分析表明，饲喂HCD的HCC幼鱼中这些细胞的数量和密度均显著增加。

相比之下，在喂食高胆固醇饮食（HCD）的HCC幼鱼中观察到T细胞密度在总体数量上显著下降。保持水箱清洁和喂养是确保幼鱼存活率的最重要步骤，可避免因水质不佳或喂养不当导致对照组出现脂肪变性或肝脏及全身性慢性炎症。还可进行其他方法，如延时显微成像以及分析定植于肝脏的不同细胞之间的相互作用。

此外，可对处于不同肝癌阶段的分离肝脏进行单细胞RNA测序，以全面了解肝脏免疫微环境如何随疾病进展而演变。