利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

本实验的总体目标是鉴定遍布基因组的与蛋白质结合的DNA片段，以反映染色质的状态。为实现这一目标，需进行三项特殊操作。首先，从植物细胞中分离出完整的细胞核。

其次，在原位通过特异性抗体识别染色质的修饰。第三，该抗体结合了蛋白A-转座酶融合蛋白（Tn5转座酶），在镁离子激活下原位切割染色质。随后，DNA片段与染色质修饰结合位点被整合上接头序列，准备进行DNA文库构建。

聚合酶链式反应富集增强型测序。染色质水平的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为以及非编码RNA与其招募蛋白的相互作用，可实现基因表达的时间和空间控制。由Henikoff实验室开发的CUT&Tag技术是一种高效染色质表观基因组分析的酶锚定方法。

本研究以棉花叶片为实验材料，以组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（Histone H3 Lysine-4 Trimethylation）抗体为例，进行染色质谱型分析。我们提供了一套优化的植物CUT&Tag实验流程，并配有操作视频。每次进行CUT&Tag样品制备时，需采集一克棉花叶片组织。

将叶片与液氮研磨成细粉，转移至含有25 mL预冷的细胞核分离缓冲液A的50 mL Falcon管中。轻轻混匀缓冲液，将管子置于冰上孵育5分钟，并轻轻振荡以使材料均匀分散。随后在4°C下以500 × g（相对离心力，rcf）离心5分钟，形成细胞沉淀。弃去上清液，沉淀用20 mL含有0.5%吐温-100（Triton）的预冷细胞核分离缓冲液B重悬。

轻轻颠倒离心管，以充分重悬沉淀。随后使用两种筛网组合过滤所得的细胞裂解液，上层使用500目筛网去除较大的组织碎片，下层使用1000目筛网收集细胞核。

选择合适孔径的筛网取决于植物细胞核的大小。在筛网背面使用无菌滤纸，以吸收部分裂解液和微小的细胞碎片。将含有细胞核的裂解液转移至新的1.5毫升离心管中，在4°C下以300 ×g离心4分钟，以收集细胞核。

离心后，使用移液枪头尽可能吸除上清液。加入800 µL的细胞核洗涤缓冲液，轻轻颠倒离心管以重悬细胞核。

将离心管在4摄氏度下以300 rcf离心4分钟。经过总共三次洗涤后，将所得的细胞核合并至一个新的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下以300 rcf再次离心4分钟。使用移液器吸头尽可能吸除残留的缓冲液。

下一步是抗体的孵育。取50微升的细胞核重悬于1毫升抗体缓冲液中，缓冲液中添加了EDTA、BSA、蛋白酶抑制剂混合物和皂苷。每个反应取150微升细胞核悬液置于新的1.5毫升离心管中，每管加入2微升抗体。

本实验中，加入抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体和免疫球蛋白G阴性对照抗体后，分别设置两个生物学重复。轻轻混匀溶液，将离心管置于4°C、12 rpm条件下，在水平摇床上过夜孵育进行杂交。次日早晨取出离心管，使用800 µL免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤细胞核。

轻轻颠倒试管以混匀，并在室温下以12 rpm置于水平摇床上5分钟。洗涤后，将试管在4℃下以300 rcf离心4分钟。离心后，使用移液器吸头弃去上清液。

重复上述步骤，共洗涤三次。第三次洗涤后，将离心管在4°C、300 rcf条件下离心两分钟，并用移液枪头尽可能吸除残留的缓冲液。接下来配制Tn5转座酶反应混合物用于孵育。

向每150 µL转座酶孵育缓冲液中加入1 µL转座酶。我们建议根据反应数量预先配制转座酶溶液混合物，然后向每根试管中加入150 µL等份溶液。

将溶液轻轻混匀，并在室温下以12 rpm置于水平摇床上孵育2小时。每10至15分钟轻轻混匀一次试管。孵育结束后，使用800 µL免疫沉淀洗涤缓冲液在室温下洗涤细胞核三次，以去除未结合的Tn5转座酶。

第三次洗涤后，将离心管在4 °C条件下以300 × g离心两分钟，并用移液器吸头吸除残留的缓冲液。进行标签化（tagmentation）步骤时，向反应管中加入300 µL标签化缓冲液。充分混匀溶液，并在37 °C孵育1小时。

孵育后，加入10微升0.5摩尔/升EDTA和30微升10% SDS以终止反应。随后加入300微升DNA提取缓冲液。进行不规则DNA提取。

将DNA片段溶解于25 µL无菌水中，其中24 µL用于NGS文库构建中的PCR扩增。该图显示了在显微镜下成像的DAPI染色完整细胞核；获得足量且相对纯净的完整细胞核是CUT&Tag实验的关键步骤。

PCR 后，取 2 µL 进行转移，并在 1.5% 琼脂糖凝胶上检测 DNA 片段大小。该图显示，与免疫球蛋白基因阴性对照相比，组蛋白 H3 赖氨酸 4 三甲基化样品中的大部分 DNA 片段长度应在 280 至 500 个碱基对之间。

DNA片段可经过纯化后通过高通量测序进行分析。该图展示了抗组蛋白H3赖氨酸4三甲基化抗体组与免疫球蛋白G阴性对照组的测序结果。该技术利用少量细胞，通过相较于ChIP-seq更为简化的流程，即可实现高分辨率、极低背景信号的DNA文库构建。

CUT&Tag 是一种新方法，目前仍在不断完善中。