在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

本方案描述了一种利用新型胰腺活体成像窗口对活体小鼠胰腺进行稳定且可重复的细胞水平在体成像的方法。该技术的主要优势在于，可在活体小鼠的胰腺中实现长达三周的无运动干扰、三维、细胞水平分辨率的成像。首先准备手术平台，并用70%乙醇对表面进行消毒。

麻醉后，使用带有恒温控制加热垫的直肠探针监测小鼠体温。去除小鼠左侧 flank 部的毛发，并交替使用酒精和碘酒消毒，从切口部位向外周旋转擦拭，切勿返回切口区域，最后以碘酒擦拭结束。随后，在小鼠左侧 flank 部做一长度为1.5厘米的切口，逐层分离皮肤和肌肉组织。

使用黑色或尼龙4-0缝线在切口边缘行荷包缝合。用环形镊子小心牵拉脾脏，辨认胰腺。将窗口置于小鼠侧腹部，使脾脏和胰腺通过窗口的开口处。

然后，将胰腺轻轻放置在成像窗口的平板上，同时将脾脏置于窗口的开放区域。将 PANC-1 nuclite red 直接注射到胰腺中。使用 31 号导管针将 n-丁基氰基丙烯酸酯胶水滴加至成像窗口边缘，注意胶水量应尽可能少。

轻轻将一个12毫米圆形盖玻片置于成像窗口边缘。然后，握住缝合线环，使其嵌入窗口的侧沟槽内，并打结三次。最后，为防止小鼠清醒后活动导致这些紧密缝线断裂，剪断结扎线最靠近近端的位置。

首先打开活体显微镜及其激光电源。插入血管导管时，用食指和中指按压尾部近端以施加压力。如有需要，可用灯加热尾部。

用70%乙醇喷雾消毒尾静脉，然后将30号导管插入侧尾静脉，并观察PE-10管中血液反流。用丝线胶带固定导管以保持稳定。根据荧光探针的组合，注射FITC葡聚糖和TMR葡聚糖，或其他适当的荧光探针。

插入直肠探头，通过恒温加热垫系统自动控制体温。然后，将活体显微镜设置过程中制备的胰腺成像窗插入窗夹持器中。将小鼠从手术平台转移至成像载物台。

进行活体成像时，首先使用较低放大倍数（例如4倍）对胰腺进行成像，以扫描胰腺成像窗口中胰腺的整体视野。确定感兴趣区域后，切换至较高放大倍数的物镜（如20倍或40倍），以实现细胞水平的成像，其横向和轴向分辨率分别约为0.5微米和3微米。通过Z轴层扫或时间序列成像，观察三维结构或细胞水平的动态过程，例如细胞迁移。

活体显微镜结合胰腺活体成像窗口可提供长期的组织稳定性，从而实现高分辨率成像，能够对单个胰岛进行长达三周的追踪观察。在C57 black 6 N小鼠体内植入的成像窗口，结合静脉注射的与Alexa 647荧光染料偶联的抗CD31抗体，实现了胰腺的大范围成像以及放大后的三维成像。通过自发荧光和抗CD31抗体分别对邻近血管系统进行可视化，可在胰腺组织的平均图像中识别出腺泡细胞。

利用马赛克成像法（该方法结合了宽视野与高分辨率成像），在MIP-GFP小鼠中可视化了约40至50个胰岛及其邻近的血管结构。先前的研究表明，利用这种稳定的成像方法可对胰岛进行长达三周的追踪观察。为了可视化癌细胞，在手术过程中将PANC-1 nuclite red细胞直接植入小鼠胰腺，并使用与Alexa 647偶联的抗CD31抗体对邻近血管进行染色。

通过该方案，获得了胰腺癌的宽场图像，有助于界定肿瘤边界，并实现单细胞水平的高分辨率三维成像。该方法中最关键的步骤是在小鼠体内熟练植入胰腺成像窗。

利用其他组合的荧光小鼠细胞和抗体探针，可以识别邻近细胞与胰岛或肿瘤细胞之间的动态相互作用。该方法可广泛应用于研究各种病理生理条件和原位胰腺癌微环境中胰岛变化的研究者。