利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠固有心脏起搏功能缺陷

测量固有心率是评估心脏健康的重要指标。该技术能够准确测量这一指标，同时排除大多数对窦房结的干扰因素。通过微电极阵列（MEA）记录固有心率，可获得与单细胞记录相似的精确放电率数据，且无需接受 extensive 的电生理学培训。

初学者在使用该技术时，可能在早期实验中难以获得健康的组织样本，因此在开始正式数据采集之前，应先练习解剖操作，并优化缓冲液配方及数据采集参数。本实验操作将由本实验室的博士后研究人员 Man Si 博士和 Praveen Kumar 博士进行示范。首先用止血钳夹住已实施安乐死的小鼠皮肤，然后使用手术剪从左侧肋弓至右侧肋弓，在肋骨下缘稍下方的皮肤处做一个横向切口。

使用手术剪切开腹膜，并小心地将肝脏从膈膜分离，避免划伤肝脏以防止大量出血。沿胸腔切开膈膜以暴露胸腔。使用手术剪从肋弓边缘向上至锁骨处剪开肋骨的侧壁，以暴露心脏，然后使用23号注射器针头将肋骨固定在肩部上方。

使用移液管将温热的含肝素完全台氏液滴加到心脏上，以保持其湿润。用超细格拉夫镊子夹住肺部，用手术剪剪断气管以去除肺部。在取出心脏时，用超细格拉夫镊子夹住心脏心尖，用手术剪剪断主动脉和下腔静脉。

将心脏转移至含有固化硅胶弹性体的培养皿中，并使用移液管向心脏灌注2至3毫升温热的含肝素完全台氏液。用解剖针将心脏心尖固定于培养皿上。用Dumont 2号椎板切除钳夹持下腔静脉。

使用22号注射针头穿过下腔静脉和上腔静脉，以确定其在右心房的位置，从而间接标定窦房结的大致位置。用Dumont 2号椎板咬合钳夹住右心耳，并用解剖针穿过右心耳以固定其位置。对左心耳重复相同操作，随后移除贯穿腔静脉的注射针头。

使用Castroviejo剪刀在心室水平进行横向剪切，切除心脏心尖以释放心脏内的血液，随后加入温热的含肝素完全Tyrode's溶液冲洗心脏。使用Castroviejo剪刀沿房室间隔剪切，直至将心房与心室分离，并使切口靠近心室侧。沿房间隔剪切以去除左心房。

将解剖针插入右心房的周边，使其平铺展开。使用卡斯特罗维耶霍剪刀去除心房上残留的脂肪、血管或组织，并在右心房内定位窦房结。向灌注液模型中加入台氏液，并打开碳酰气（carbogen）气流以氧合台氏液。

将蠕动泵设置为25 RPM，以获得每分钟2毫升的流速。启动泵后，确保缓冲液无泄漏，并将温度控制器设定为37摄氏度。使用Dumont 55镊子将解剖好的组织从解剖用培养皿转移至微电极阵列网格上。

使用软毛画笔轻轻移动组织，使其覆盖电极网格的窦房结区域。然后用骨科镊子或任何弯曲镊子将网状结构放置在组织上。使用骨科镊子将竖琴锚固定在网格上，以确保所有部件位置固定。

将微电极阵列培养皿放置在连接板上。小心地将灌流帽置于微电极阵列培养皿上，避免扰动网格切片固定锚，并用胶带固定灌流间隙。打开放大器，并在软件中设置记录的实验流程。

选择 beat_recording.moflo 模板。打开后，根据所需的记录条件设置迹线数量、迹线持续时间、迹线间隔、输入电压、采样率及其他记录参数。

点击记录和播放按钮，开始记录并采集10次轨迹数据，每次持续一分钟，轨迹之间间隔两分钟。暂停泵的运行，将泵的进液管从正常记录液切换到含有选定药物的台罗德溶液（Tyrode's solution）。重新启动泵并继续记录。

当含药物的台氏液到达组织后，以与基线记录相同的方式记录10次信号。最后拍摄一张组织在微电极阵列上位置的照片。在分析软件的搏动频率分析模板中打开已保存的记录数据文件。

单击播放按钮，运行整个记录以进行数据可视化，然后设置相应的分析参数。选择要包含在分析中的通道，并设定所需的振幅最大值或振幅最小值阈值，以实现对波形峰的自动识别。再次单击播放图标以重新运行数据集，确认分析参数适用于动作电位的提取。

用于分析时，需在实验基线期，在大多数通道中识别出三个跳动频率最稳定的连续轨迹，另在药物暴露期再识别三个连续的稳定轨迹。点击播放和记录图标以开始分析。数据来自一只45日龄雄性野生型黑瑞士小鼠，用于窦房结搏动频率的测量。

在不同通道中观察到具有不同形状和幅度的波形，所有通道均显示出相同的峰间间隔和放电频率。然而，组织与电极的接触程度也可能影响波形特征，例如幅度。从记录的10条轨迹中，选取了三个连续且具有稳定搏动频率和峰间间隔的通道用于进一步分析。

异常提取的尖峰模式应当不存在，如果出现，则可能是受到噪声影响或不稳定所致。对应于单个心跳的波形反映了心脏固有的起搏活动。微电极阵列系统便于施加药物试剂，以分析其药理学效应。

在所有64个通道中，所选三条轨迹的固有放电频率在采样数据中约为每分钟320次。如预期，加入4-氨基吡啶后，峰间间隔增加，使搏动频率从每分钟320次降低至每分钟210次。为收集可靠的分析数据，在记录过程中需确认组织处于健康状态，方法是验证轨迹稳定并符合标准判据。

MEA可用于记录心脏其他区域的心脏活动，从而实现详细的区域特异性表征，便于研究遗传和药物干预的影响。