优化实验装置与条件 离体 用于研究大小眼视网膜功能的视网膜电图

本方案展示了在离体ERG中维持视网膜功能所需的条件，特别是由ON-双极细胞产生的极为敏感的B波。通过离体ERG，我们可以在允许方便引入药理学试剂的同时，以高信噪比测量不同类型视网膜神经元的功能。该方法特别适用于定量评估药理学试剂对视网膜功能及疾病的影响。

首先，通过将离体ERG标本架经前置放大器连接至差分放大器，构建多电极阵列系统。该放大器必须插入多电极阵列系统的接口板的模拟输入端口。使用多电极阵列系统的记录软件来记录并存储来自离体ERG的输入数据。

将差分放大器的增益设为100，并根据采集卡的规格额外增加10倍电压放大。将低通滤波器设置为100赫兹。或者，若要改装膜片钳装置，可通过前置放大器将离体ERG标本架连接至差分放大器，该差分放大器必须连接至膜片钳放大器的前置放大器端口。

使用膜片钳系统软件和数据采集器记录并存储离体ERG的输入数据。参数设置参照前文所示。将具有适当波长的LED连接至显微镜。

为了控制光刺激，使用由采集卡模拟输出控制的LED驱动器。通过记录软件控制LED，该软件能够触发光刺激。然后，使用光电二极管在标本架中视网膜位置处校准LED的光输出。

如有需要，可插入中性密度滤光片以减弱光路中的光强。准备电极时，将银/氯化银颗粒电极插入螺纹诱捕器连接头中。用热熔胶填充诱捕器连接头内部，并从非螺纹一侧将一个2毫米插座插入热熔胶中。

将EP-1电极的银丝焊接到两毫米插座上。将带有O形圈的成品电极旋入离体ERG标本夹的电极接口中。对于较大的眼睛（包括人供体眼睛），需清除眼球上残留的结缔组织，并去除前节段和晶状体。

使用手术刀在距角膜缘约三毫米处做一切口。将弯剪插入切口，沿角膜缘剪开，以去除带晶状体的眼前段。使用直径三至六毫米的一次性活检打孔器获取视网膜标本，用于离体视网膜电图检测。

将组织固定在样本架上时，先将样本架的下半部分放入一个大型培养皿中，并加入充氧的Ames'培养基，使样本架的圆顶部分刚好浸没。用精细镊子小心夹住视网膜边缘，将视网膜转移至离体样本架的圆顶上，感光细胞面朝上。从Ames'溶液中提起样本架，注意保持视网膜位置不变。

将标本夹持器的平板彻底干燥，以尽量减少噪声、电串扰和信号分流。然后用四颗螺丝将标本夹持器的两半组装在一起，并连接灌流管路。将电极插入标本夹持器的下半部分，将阳极导线连接至视网膜内侧，阴极导线连接至光感受器侧。

以每分钟至少一毫升的含氧Ames'培养基灌注标本架，持续10至20分钟，以使光反应趋于稳定。离体ERG技术可记录小鼠视网膜中感光细胞和ON-双极细胞的光反应。对于人供体视网膜，感光细胞反应可在摘除眼球后最长5小时的死后延迟时间内成功记录，而ON-双极细胞反应则需在20分钟内完成记录。

在理想条件下，两种细胞类型的反应幅度和动力学随时间相对稳定，但在视网膜安装到样品台后40至45分钟开始出现缓慢下降。降低样品台的温度显著减缓了光感受器和ON-双极细胞的动力学反应速度。然而，这种降温会降低B波的幅度，但对A波的幅度无影响。

相反，降低灌注速率会减小光感受器和ON-双极细胞反应的振幅，但对A波和B波的潜伏期均无影响。停止灌注10分钟后恢复灌注，会导致ON-双极细胞功能完全丧失，而光感受器反应仍得以保留。足够的灌注速度和生理温度对于获得稳定的反应至关重要，特别是对于离体ERG中的ON-双极细胞。

本方案可深入探究人类黄斑区与周边视网膜光感受器功能的差异，解决了以往仅能在非人类灵长类动物中开展的研究问题。