通过时空涨落光谱探测转运亚细胞纳米结构的结构与动态特性

成像正确均方位移方法能够同时提取活体样本中目标生物对象的结构和动态平均特性。成像正确均方位移是一种快速且稳健的流程，无需提取单个对象的轨迹，也无需复杂的标记。它仅需要一个标准的光学装置和一个荧光标记的目标对象。

该方法为大规模、定量筛选多种病理状态下（如癌症、糖尿病或神经退行性疾病）亚细胞纳米结构水平的结构与动态改变铺平了道路。本实验操作将由我实验室的博士生 Fabio Azzarello 演示。开始细胞传代时，先用 0.01 M PBS 将一个 10 厘米、经组织培养处理且已长满 hela 细胞的培养皿清洗两次。

然后，加入1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。用9毫升完全DMEM培养基重悬脱落的细胞，并将含胰蛋白酶的总共10毫升培养基收集至离心管中。每35毫米×10毫米培养皿接种约20万个细胞，最终培养基体积为1毫升，随后孵育细胞。

根据所关注的亚细胞结构，需要采用特定的标记方法；一旦标记溶液准备就绪，用 0.01 摩尔 PBS 将细胞洗涤两次。用含有染料试剂的培养基替换 PBS 后，按照制造商的建议，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育培养皿。孵育结束后，在实验前用新鲜培养基将细胞洗涤两次。

在进行延时序列采集之前，打开显微镜培养箱控制系统，使显微镜在37摄氏度和5%二氧化碳条件下平衡约两个小时。使用488纳米氩离子激光器激发转染细胞中的EGFP以及荧光标记的巨胞饮体，并通过标准光电倍增管检测器收集500至600纳米范围内的荧光发射信号。使用543纳米氦氖激光器激发荧光染料，并收集555至655纳米范围内的发射光信号。

将检测针孔的直径设置为一个艾里斑（Eri）的大小。每次采集时，连续收集1000帧图像。将像素驻留时间设置为每像素2微秒，以实现每帧129毫秒的成像时间。

为正确初始化采集的仪器参数，请使用软件文本编辑器打开 iMSD.M。通过输入以下数值来设置参数：N' 表示时间序列中的帧数，以微米为单位的像素尺寸，以及 f' 表示以秒为单位的时间分辨率。

此外，将滤波背景校正输入设置为零，以处理原始图像；或设置为一，以执行基于阈值的背景减除。接下来，设置背景校正的平均灰度值（AV toll）阈值。如果滤波值设为一，则强度低于阈值的像素将被设为零。

接下来，将 bit 设置为决定强度采样的整数。保存并运行编辑后的 iMSD.M 脚本文件。

在命令窗口中检查脚本执行情况，如果出现问题，将显示中断警告信息。脚本成功执行后，导入图像序列并根据需要减去背景。然后，使用傅里叶方法计算时空相关函数。

使用二维高斯函数拟合时空相关函数。接着，通过 IMSD 曲线及相应的拟合曲线检查图形输出结果，这些曲线根据不同类型的拟合方程分别显示在三个独立的面板中。图例中提供了决定系数（R 平方值）。

然后，检查文本输出。以溶酶体作为测试细胞器的图像采集，在活细胞中以适当的时间分辨率和极低的时间分辨率进行。在低分辨率图像中，由于细胞器运动导致的溶酶体伪影形变清晰可见。

使用图像分析软件中的线条工具获取了光斑的强度分布曲线。随后，通过将强度数据以高斯函数进行绘图和插值，估算了光斑的直径。高速采集所获得的平均结构尺寸与固定样品相近。

相反，由于成像过程中自然的结构动态变化，以较慢速度进行采集会增大结构尺寸。在运输过程中观察了大胞饮体的结构和动态特性。观察结果显示，大胞饮体的平均尺寸减小。

亚扩散运动的同时增加表现为减小的 alpha' 值。在每次检测中，均观察到随时间推移巨胞饮体数量的增加。相比之下，在ISG上进行的类似测量表明，这些细胞器的行为与巨胞饮体有显著差异。

事实上，胰岛素颗粒表现出稳定、平均的结构或动态特性，表明它们处于静止状态被检测。如果两种不同的细胞器被分别标记，该方法可轻松应用于双色模式。在这种情况下，互相关分析将揭示细胞内两种对象之间潜在的动态相互作用。