酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中线粒体亚结构蛋白定位的评估

本方案旨在确定酵母线粒体蛋白的亚线粒体定位，这是阐明线粒体蛋白功能的基本步骤。该方案适用于在不同培养条件下维持的酵母菌株。作为一种研究线粒体的有力工具，本方法在科研中具有重要应用价值。

首先，从保存在 -80 °C 的甘油菌种中取菌，在 YPD 琼脂平板上划线，以分离目标菌株的单菌落。将平板在 30 °C 下培养 2 至 3 天。通过挑取 YPD 琼脂平板上的 2 至 3 个单菌落，接种于含有 10 至 30 ml YPGal 培养基的 100 ml 三角烧瓶中，制备预培养液。

将锥形瓶在30 °C、180至200 rpm剧烈振荡条件下培养24小时。将种子培养物按稀释后600 nm处光密度低于0.1的比例接种于1 L新鲜YPGal培养基中。在30 °C、180至200 rpm剧烈振荡条件下培养细胞约12小时，直至光密度达到1至1.5。

按照文中所述方法分离高纯度的线粒体。使用Bradford法测定高纯度线粒体制剂的蛋白浓度，具体操作遵循试剂盒说明书。用预冷的SEM缓冲液将蛋白浓度调整至10 mg/ml。

将40 µL高纯度线粒体转移至四个预冷并标记的1.5 mL微量离心管中。在第一和第二管中加入360 µL SEM缓冲液，在第三和第四管中加入360 µL EM缓冲液。

根据文中所述的移液方案，向第二和第四支试管中各加入 4 µL 新鲜配制的蛋白酶 K。轻轻混匀所有试管后，置于冰上孵育 30 分钟，期间偶尔混匀。为终止蛋白酶 K 活性，向全部四支试管中各加入 4 µL 200 mM PMSF。

在 4 °C 条件下，以 20,000 × g 离心 30 分钟。将上清液小心转移至新的预冷的 1.5 ml 带标签微量离心管中，注意不要扰动沉淀。接着，用 400 µL 冰冷的 SEM 缓冲液重悬沉淀。为灭活可能残留的蛋白酶 K，向收集的上清液中加入三氯乙酸，使终浓度为 10%，沉淀蛋白。将离心管置于冰上孵育 10 分钟。

将经三氯乙酸处理的样品在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。去除上清液后，用 200 µL 样品缓冲液重悬沉淀。如果溴酚蓝变为黄色，加入 1 至 5 µL 1 M Tris 碱，直至溶液变为蓝色。向所有试管中加入 4 µL 200 mM PMSF。

将样品储存于 80 °C，直至进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析。取 200 µL 高度纯化的线粒体转入预冷的 1.5 ml 微量离心管中。用预冷的 SEM 缓冲液将线粒体等体积稀释。

使用适用于小体积样品的超声破碎仪，在冰上对线粒体进行3次超声处理，每次30秒。在4°C下以100,000 × g离心30分钟，并将上清液收集到一个新的预冷的1.5 ml微量离心管中。将试管标记为S（可溶性蛋白组分），并置于冰上保存。

将上一步骤中获得的沉淀物重悬于400 µL预冷的SEM缓冲液中。取100 µL重悬后的沉淀物转移至一个新的预冷1.5 mL微量离心管中。将该管标记为SMP（即亚线粒体颗粒组分），并置于冰上保存。

将重悬后剩余的300 µL沉淀物用新配制的200 mM碳酸钠溶液等体积稀释。将稀释后的样品置于冰上孵育30分钟。然后在4 °C、100,000 × g条件下离心30分钟。将上清液收集至新的预冷1.5 mL微量离心管中。

将样品标记为 CS，代表碳酸盐上清组分，并将试管置于冰上。将前一步骤中获得的沉淀物用 400 µL 冰冷的 SEM 缓冲液重悬，并将该样品命名为 CP，代表碳酸盐沉淀组分。

将所有样品用三氯乙酸沉淀至终浓度为10%，并在冰上孵育10分钟。随后，在4°C、12,000 × g条件下离心10分钟。去除上清液后，用样品缓冲液重悬每一份沉淀。如果样品缓冲液变为黄色，加入1至5 µL的1 M Tris碱溶液，直至溶液变为蓝色。

向所有试管中加入 1 l 的 200 mM PMSF，并在 -80 °C 下保存，直至进行 SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析。通过蔗糖密度梯度离心法纯化粗线粒体组分，观察到其他细胞污染物的减少。通过检测沉淀中线粒体膜间隙蛋白细胞色素 b2 的消失来监测线粒体向线粒体外膜破裂体（mitoplast）的转化。

上清液中同时出现。由于渗透休克导致线粒体外膜破裂，膜间蛋白Sco1被蛋白酶K降解。通过检测沉淀组分中细胞色素b2和Sco1免受蛋白酶K降解，证实了线粒体外膜的完整性。

同样，基质可溶性蛋白 KGD 的保护作用证实了线粒体内膜的完整性。Prx1 的 Western 印迹图谱提示其在膜间隙和基质中均存在，具有双重线粒体定位。为研究膜蛋白的拓扑结构，将线粒体进行超声处理和碳酸盐提取。

整合膜蛋白在沉淀组分中保留。KGD 在上清液组分中被检测到。在沉淀中检测到 KGD 蛋白是由于超声参数的变化影响了 SMPs 的形成。

经碳酸钠处理后，KGD 和 SMP 组分被溶解并存在于上清液组分中。Prx1 的 Western 印迹图谱提示其与膜周边相关。为了确保亚线粒体分级分离实验的成功，低渗膨胀后必须通过向样品中添加 PMSF 来终止蛋白酶 K 的活性。

这些位点提供有关线粒体亚结构蛋白定位的信息。该方案还可用于检测线粒体制备物的完整性，这在进行线粒体亚区室蛋白质组学研究时至关重要。