设计与开发用于研究补充氧气对囊性纤维化气道微生物组影响的模型

这些实验方案旨在模拟补充氧气使用对囊性纤维化患者肺部微生物组的体外影响。该培养基配方经过优化，以模拟囊性纤维化患者痰液的生理组成。通气过程使得能够在不同氧浓度条件下进行培养。

对人工痰液培养基进行调整可使其模拟其他慢性肺部疾病，并在不同条件下构建微生物群落模型，例如囊性纤维化合并糖尿病患者中不同的葡萄糖浓度。人工痰液培养基制备步骤概览显示了将制备好的 ASCM、ASMM 和 ASBM 混合的过程。使用 MOPS 缓冲液将 pH 值调节至 6.3，并在冷室中于旋转摇床上对培养基进行过滤除菌。

首先，通过将250毫升ASCM加入含有ASMM的1升瓶中来制备人工痰液培养基。然后向培养基瓶中加入250毫升ASBM。用1摩尔的MOPS碱性缓冲液滴定培养基，使pH试纸显示pH值达到6.3。

将人工痰液培养基在 4 摄氏度下冷藏，直至进行过滤。然后，将 200 毫升未过滤的人工痰液培养基转移至带有孔径为 0.22 微米滤膜的真空过滤系统，以开始过滤过程。将过滤系统连接至真空泵后，打开真空泵，随后将滤液收集室置于低温室（4 摄氏度）中的轨道摇床上，以每分钟 90 转的速度振荡。

为避免堵塞问题，当过滤完350毫升培养基后更换滤器。过滤一定量后，额外再加入150毫升培养基进行过滤。重复使用额外的滤室进行过滤，直至所有培养基均完成过滤。

氧气通气概述，演示将患者痰液加入灭菌血清瓶中的人工痰液培养基内，随后向密封的血清瓶中通入混合气体。最后，将血清瓶孵育，并在24小时时间点取培养物 Alec Watts 进行后续宏基因组测序。

开始血清瓶培养的气体鼓泡前，用样本编号、接种日期和时间以及目标氧气百分比标记500毫升已灭菌的血清瓶。在生物安全柜中，向每个待用的血清瓶中加入24毫升人工痰液培养基。为获得每种培养条件下足够的样本体积，必要时可用无菌磷酸盐缓冲液稀释样本，再用18号针头将痰液匀浆化，然后向每个血清瓶中加入1毫升患者痰液样本。

接下来，使用无菌镊子将已高压灭菌的橡胶塞放置在每个血清瓶的瓶口顶部，向下按压橡胶塞时避免触碰其底面。将瓶子移出超净工作台后，套上铝盖并进行压封。取下铝盖中心部分，用酒精棉片擦拭瓶口顶部，并将瓶口通过本生灯火焰灭菌。

现在将一个无菌的18号针头连接到带有滤器的柱塞式注射器上，并先将连接好的排气注射器插入瓶中。接着，将另一个无菌的18号针头连接到系统的气体出口，并将该气体出口针头也插入瓶中。将来自气瓶的T型接头通过氧气监测仪进行布线。

在确认流经系统的目标氧气浓度后，将气体流速调节至每分钟约五升。将三通接头从气瓶重新连接至气体输出端。当气体开始流经血清瓶时，需密切观察压力表，若压力出现异常升高，应立即关闭系统。

运行后，以每分钟5升的流速向血清瓶中通入氧气1分钟，该设置可实现10次空气置换，确保瓶内气氛达到100%氧气的所需浓度。随后移除排气用的18号针头。待血清瓶内压力升至1个大气压后，立即拔除气体输出针头。

将血清瓶置于37摄氏度摇床培养箱中，以每分钟150转的速度孵育，分别在3个24小时时间点进行。每次24小时时间点时取Alec Watts用于后续分析，并对样品重新通气。此处示例展示了培养物在孵育前后的可能形态。

在37摄氏度条件下培养痰液样本的过程中，持续监测了流出液中的氧气和pH水平。无论是12小时还是24小时的通气间隔，三种条件下的氧气浓度均在时间过程中基本维持稳定，仅观察到氧气浓度出现适度下降。所测得的pH值均处于生理范围内，且随时间无显著变化。

对未培养和培养痰液中的微生物载量、多样性和群落组成进行比较，结果显示培养痰液中的微生物载量增加了20倍。多样性指标表明，培养过程对群落组成具有较好的保留性，仅引入了轻微的整体差异。通过宏基因组测序对培养与未培养痰液中的120种微生物物种进行了比较分析。

在未培养和已培养的样本中均鉴定出其中46个物种。而有35个物种仅在未培养样本中鉴定出，39个物种仅在已培养样本中鉴定出。基于吸光度生成了常见CF肺部病原体的生长曲线，这些病原体由患者样本分离物在人工痰液培养基中、正常21%氧气浓度条件下培养获得。

仅含ASM的阴性对照在600纳米处的光密度随时间无变化，表明培养物无污染。观察到典型的生长曲线模式，表明ASM培养基可用于通过光学方法生成生长曲线。本研究采用宏基因组测序来描述微生物群落组成。

其他技术，例如宏转录组测序可用于评估基因表达，或代谢组学用于评估代谢物的产生。