高通量、稳健且高度时间灵活的拟南芥种子表面灭菌方法

本方案改进了模式物种拟南芥（Arabidopsis thaliana）功能基因组学研究中的种子表面灭菌步骤。该技术的主要优势在于操作简便且通量高，每天可处理数百个样品。通过一些简单的修改，该方法还可应用于许多其他模式和非模式植物物种。

对于初次使用者，请注意培养基的温度和离心速度，这两者对种子存活均至关重要。首先，通过将95%工业乙醇加入蒸馏水中并充分混合，配制70%乙醇。接着，将5毫升家用漂白剂加入95毫升无菌蒸馏水中，配制5%次氯酸钠溶液。

然后，向漂白液中加入几滴非离子型去污剂，并充分混匀。接着，通过在800毫升蒸馏水中加入含维生素的2.2克MS培养基粉末和10克蔗糖，配制半倍浓度的Murashige和Skoog培养基。用1摩尔氢氧化钾将培养基的pH值调节至5.7，再用蒸馏水定容至1升。

将500毫升培养基分装至一个1升的瓶子中，并加入4克琼脂以制备固体培养基。高压灭菌后，将培养基置于水浴中冷却至50至53摄氏度，然后在超净工作台中倒入培养皿中。

制备选择性培养基时，将卡那霉素加入培养基中，并如前所述倒入培养皿。设置抽滤装置时，将真空泵的进气口连接至一段合适尺寸的聚乙烯管的一端，然后将管的另一端连接至倾析瓶双通盖的出口。

用密封膜将管路的连接处紧密包裹，以确保气密性连接。接着，将一根聚乙烯管连接到倾析瓶螺旋盖的进样口。然后，将该管的另一端连接到装有细聚乙烯管的水族箱阀门的出口。

如有必要，用封口膜包裹连接处以防止漏气。将两组共96个1.5毫升离心管用连续编号标记后，向每个无菌的1.5毫升离心管中加入100至200粒拟南芥种子，种子量约为填至管底锥形末端上方一至两毫米处。接着，使用10毫升无菌刻度移液管，向每管中加入约1毫升70%乙醇，并小心盖紧管盖。

将试管置于振荡器中，以8赫兹的振荡频率震荡3分钟。随后从振荡器中取出接头，转移至台式微量离心机的转篮中，使用瞬时离心功能使种子沉降至管底。将试管转移至试管架后，在超净工作台内打开所有试管。

不要触碰瓶盖插入管中的部分，以免造成污染。然后，在超净工作台内，将一个无菌的200微升黄色吸头安装到自制吸液器的水族阀入口，并打开泵。将吸头插入至接近种子液面的上方，避免吸取液体时接触种子。

接下来，使用一支10毫升无菌血清移液管，将1毫升5%次氯酸钠溶液分装至各离心管中。盖紧管盖后，将离心管重新放回摇床适配器中，然后按照之前演示的方法振荡混匀。使用台式离心机的瞬时离心功能使种子沉降至管底后，将一个新的无菌200微升黄色枪头安装到鱼缸阀门上，然后打开泵的电源开关。

将枪头置于种子上方，避免吸取次氯酸溶液时触碰种子。接着，使用10毫升无菌血清移液管，向每根试管中加入1毫升无菌水。在水族箱阀门上安装新的200微升无菌黄色枪头后，打开泵的电源。

将吸头插入到种子上方的位置，以避免吸取水分时触碰到种子。最后，在超净工作台中向每根试管分装500 µL无菌水，并盖紧所有管盖。种子现已准备好进行播种。

如有需要，可将离心管置于室温下数小时，或在4摄氏度下过夜。使用1毫升移液器，将种子连同300至400微升无菌水转移至培养皿中。转移10管后，向每块培养皿中加入1.5至2毫升不含抗生素的熔融态半倍浓度Murashige和Skoog培养基。

轻轻晃动培养皿以分散种子，并将培养皿相对放置并用胶带固定。用塑料膜或铝箔包裹培养皿，置于冰箱中避光冷藏三天，以获得一致的萌发效果。在第2、3、4和7天进行的萌发分析表明，使用70%乙醇进行10至40分钟的消毒时间之间，萌发率无显著差异。

然而，当灭菌时间超过40分钟时，种子的萌发率下降，相应的绿色子叶出土率也降低。根据该研究，70%乙醇处理3分钟和5%次氯酸钠处理3分钟被确定为种子灭菌的最短时间。

为了证明最初使用的种子被微生物污染，将非无菌种子直接播种在培养皿上。与无菌种子相比，非无菌种子在两天后出现真菌生长现象，并在七天的萌发期后蔓延至整个培养皿。使用同一支无菌移液器吸头处理不同种子样品进行交叉污染实验，结果显示，播种在含卡那霉素培养皿中的哥伦比亚-0（Columbia-0）生态型种子未观察到绿色子叶。

与此同时，在未添加卡那霉素的平板中播种的哥伦比亚-0（Columbia-0）种子，萌发后所有子叶均呈现绿色。这些结果表明，尽管使用同一个移液器吸头去除无菌溶液，样品之间并未发生交叉污染。该实验步骤是许多其他功能基因组学方法的基础，例如基因过表达、基因组编辑、亚细胞定位、启动子活性分析，以及蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用研究。