小鼠视网膜感光细胞区室分离的两种剥离方法及其蛋白质分析

本文展示的两种剥离技术可分离单个视杆细胞的亚细胞区室，有助于揭示健康和病变视杆细胞各特化区室中发生的重要生理过程。从小鼠视网膜中分离不同的视杆细胞区室具有挑战性。这些简单技术利用廉价且常见的实验材料，可稳定地分离视杆细胞的亚细胞区室，用于蛋白质分析。

首先，将一张滤纸放入盛有经100%氧气饱和的Ames HEPES缓冲液的培养皿中。然后，使用宽口移液管将一块从2至3月龄C57 Black 6J小鼠中分离出的视网膜矩形组织转移至滤纸上。将分离的视网膜以凹面朝上放置，并确保感光细胞朝下，面向培养皿底部。

然后，使用镊子轻轻夹住半片视网膜的边缘，将其移至滤纸上方。当视网膜位于中心位置后，向上移动滤纸，使半片视网膜接触滤纸，从而实现视杆细胞外段（ROS）与滤纸的黏附。小心地将附着有视网膜的滤纸从Ames HEPES缓冲液中取出。

将滤纸的底面放在纸巾上，轻拍两到三次以吸干。在滤纸带有视网膜的一侧滴加一滴Ames HEPES，然后再次将滤纸放回纸巾上干燥。接着，将带有视网膜的滤纸放回培养皿中，用镊子轻轻将半片视网膜的所有边缘从滤纸边缘向四周推起并展开。

小心地将视网膜从滤纸上剥离，仅触碰视网膜的最外缘，以保持其结构完整性。然后将滤纸从培养皿中提起，并在纸巾上除去多余的液体，确保与视网膜接触的一侧不接触纸巾。将带有部分ROS层的滤纸放入冰上预冷的标记管中，并使剥离后的视网膜保持浸没在Ames HEPES缓冲液中。

对该半片视网膜重复剥离过程约七至八次，以完全去除外节段（ROS）层。每次剥离后，将滤纸放入同一离心管中，以收集来自同一半片视网膜的所有ROS。将含有所有ROS滤纸片的离心管置于冰上，以备立即使用。

用镊子将剩余的去除了色素上皮的视网膜转移至适当标记的离心管中，并将离心管置于冰上以备立即使用。为准备视网膜样本进行冻干，先在培养皿中放置一片滤纸，然后将半片视网膜转移至盛有冷林格液的培养皿中。接着，用镊子小心地将视网膜翻转，使其凹面朝上，并将其移至滤纸上平放。

用手轻轻提起滤纸边缘，使半片视网膜贴附在滤纸上。继续将滤纸从林格液中取出。然后将滤纸的底面朝下放在纸巾上，小心轻拍两到三次，以去除多余液体。

接下来，用镊子夹起滤纸，在滤纸接触视网膜的一侧滴加一滴冰冷的林格氏液。再次将滤纸放置在纸巾上，以去除多余的液体。将每张附有视网膜的滤纸样本置于盛有冰冷林格氏液的培养皿中保存，直至所有样本准备好进行冷冻。

然后，使用镊子将每个样本从冰冷的林格液缓冲液中取出，确保镊子仅接触滤纸边缘，避免触碰半片视网膜。将每张滤纸的底面置于纸巾上，以去除多余液体。接着，在滤纸附着视网膜的一侧滴加一滴冷的磷酸盐缓冲液（PBS），再次将滤纸轻压在纸巾上吸去多余液体。

将所有滤纸片放入培养皿中，使用无绒擦拭纸吸去滤纸周围多余的液体。然后用铝箔紧密包裹整个培养皿，并确保铝箔边缘牢固地压入培养皿底部。在铝箔盖上刺出若干个直径为0.1至0.2毫米的小孔。

接下来，使用金属镊子将覆盖有铝箔的培养皿逐渐浸入液氮中。将样品保存在液氮中，直至准备进行冻干。进行冻干时，将覆盖铝箔的培养皿放入冻干瓶中，并按照制造商的操作说明将其连接到冻干机上。

将视网膜冻干30分钟。冻干后，取一小片胶带轻轻覆盖在冻干的视网膜表面，用镊子轻轻按压以确保其与感光细胞层粘附。缓慢揭下胶带，并确保外节段（ROS）和内节段（RIS）均已粘附在胶带上。

在断裂表面会出现一层薄而白色的膜，即反应诱导层（RIS）。为分离此反应诱导层，可将另一片胶带贴于断裂表面，并按压胶带使其贴合。

然后，将仅带有橙粉色层的胶带片段放入标记为 ROS 的微量离心管中，将带有薄白色层的胶带片段放入另一标记为 RIS 的离心管中。接着，使用胶带剥离滤纸上残留的较厚白色层，以收集剩余的视网膜组织。随后，将该分离物放入标记为 OIS 的离心管中。

若在同一天使用，将来自冻干视网膜的分离层置于室温下保存。在暗适应动物中，GNAT1 和 ARR1 的分布与其已知的暗态分布高度一致，其中 GNAT1 信号在 ROS 分离组分中明显最强，而 ARR1 信号在 ROS 分离组分中更为显著。对 GNAT1 和 ARR1 信号的定量分析显示，在 ROS 和 ROS 样品中，GNAT1 与 ARR1 在暗态与光刺激条件下的信号存在显著差异。

在暗适应和光适应的样品中，G蛋白亚基5S、细胞色素C和肌动蛋白信号均未出现在视杆外节（ROS）样品中，表明不存在其他细胞层的污染。此外，G蛋白亚基5L信号在ROS样品中清晰可见。对完整及剥离后的冻干视网膜表面进行扫描电子显微镜观察显示，在使用胶带剥离前，完整冻干视网 inflammata的表面与特征性的圆柱状视杆外节结构高度一致。

初次胶带剥离后，ROS 和 RIS 似乎已完全去除，残留的剥离冻干视网膜表面呈现出均匀的核层即为证据。后续的胶带剥离去除了剥离层自由表面残余的 RIS。该技术还表明，在光照暴露的视网膜中，GRK1 免疫反应性在 ROS 样本中最强，而在 OIS 样本中则不存在。

相反，ROS 和 RIS 样品中 PKC alpha 的信号较弱，而通过免疫荧光染色通常无法在 ROS 或 RIS 中检测到 PKC alpha。最后，不理想的胶带剥离可能导致样品轻微污染。RIS 样品中混入了部分 OIS 样品，因而出现了 G beta 5L 和 G beta 5S 两条带，并且 PKC alpha 信号增强。

在冻干视网膜时必须格外小心。如果使用不恰当的冻干技术，视网膜可能会融化，从而无法通过胶带剥离法分离不同的视杆细胞亚细胞层。将此胶带剥离法与定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结合使用，可实现将光感受器转录本与视网膜其他部分分离开来。