大鼠模型中视网膜病理生理学评估

这些技术的总体目标是评估链脲佐菌素诱导的糖尿病视网膜病变大鼠模型中的视网膜病理生理学变化。糖尿病视网膜病变是导致失明的主要原因之一。目前仍在持续探索具有更高效力和更长作用时间的药理学治疗剂，以用于糖尿病视网膜病变的治疗。

在临床前动物模型中发现药理学制剂的过程具有重要作用。这些动物模型有助于理解眼部后节组织的结构和功能改变。因此，我们将演示三种不同的技术，用于研究后节组织中的这些改变。

我们正在展示组织学技术，用于研究视网膜各层细胞的形态学变化；血-视网膜屏障（BRB）破坏检测，通过定量玻璃体中来自血浆的渗漏蛋白来评估BRB功能受损情况；以及荧光素血管造影，使用FITC-葡聚糖染料对视网膜血管系统进行可视化。使用高剂量戊巴比妥钠处死大鼠，并通过确认无心跳迹象来验证其死亡。使用手术刀片在眼球的鼻侧和颞侧区域做切口，以摘除眼球。

然后沿其边缘剪切，将眼球从眼眶中取出。清除眼球周围多余的脂肪，并将其放入5 mL固定液中。将眼球在固定液中孵育24至48小时。

固定后，将眼球从固定液中取出，转移至含有 10 mL PBS 的培养皿中。用显微镊夹住带有视神经的眼球，借助显微剪在睫状体平坦部做一小切口。沿角膜全周剪开，以分离眼球的前部杯状结构与后部杯状结构。

取出晶状体并切断视神经。沿视神经将视杯后半部分切成两半。将每一半分别转移至不同的包埋盒中。

通过逐步提高乙醇浓度，从50%至100%进行组织脱水。最后用二甲苯清除乙醇。使用60摄氏度预热的石蜡浸润组织，以置换组织中的二甲苯。

使用钢制模具制备石蜡包埋块，将组织和包埋盒置于模具底部。在制备包埋块时，眼球的视盘部分应朝向钢制模具的底部。用石蜡填充包埋盒，然后转移至冷却表面。

将刀片和样品盒安装到切片机的相应夹持装置上。使用切片机修除多余的石蜡，并切出5至6张厚度为5微米的连续切片条带。将切片条带转移至预热的水浴表面，使其展开。

将切片收集到涂有白蛋白的载玻片上，在37摄氏度下干燥过夜。进行苏木精-伊红染色时，先将载玻片在60摄氏度下预热1小时，以熔化石蜡。

按照手稿中所述的染色步骤进行操作。首先对组织进行复水，然后依次使用苏木精和伊红染色。接着对组织进行脱水，并在切片上加入封片介质。

将盖玻片置于切片上，并在光学显微镜下观察。为进行血-视网膜屏障破坏检测，使用氯胺酮和赛拉嗪麻醉大鼠，并通过脚趾夹捏法确认麻醉状态。找到心脏后，用1 mL注射器配24号针头进行心脏穿刺以抽取血液。

采集到足够的血液后，将其转移至经EDTA包被的试管中。轻轻混匀，以防止溶血。摘除眼球并立即置于干冰中。

在冷冻条件下，开始解剖眼球，去除角膜和晶状体。用镊子从眼球后段取出玻璃体，注意避免视网膜污染。将其转移至含有三到四个研磨珠的匀浆管中。

使用珠磨匀浆器以中等速度匀浆样品，持续10秒。将血液和玻璃体液样品转移至微量离心管中以进行后续处理。在4摄氏度条件下，以5,200 g离心力离心两种样品各10分钟。

使用多通道移液器，向各孔中加入 250 微升考马斯亮蓝试剂。用 PBS 将玻璃体样本稀释 10 倍，血浆样本稀释 20 倍。向考马斯亮蓝试剂中加入 5 微升稀释后的样本，并充分混匀。

将样品孵育20至30分钟，然后使用96孔板读数仪在590纳米处测定吸光度。样品的强度与蛋白质浓度成正比。进行荧光血管造影时，使用3%异氟烷麻醉大鼠，并通过足趾刺激确认麻醉状态。

注射染料前将尾巴浸入温水中。向尾侧静脉注射1 mL浓度为50 mg/mL的FITC-葡聚糖溶液。让染料循环5至10分钟。

使用戊巴比妥处死大鼠，并通过无法检测到心跳来确认其死亡。摘除眼球并进行视网膜平铺制备。制备视网膜平铺标本时，将眼球置于无纤维的Kimwipe上，剪除眼球的前部结构。

缓慢地将晶状体连同玻璃体从眼球的后段取出。将后段组织转移至盛有PBS的培养皿中，并剪断视神经。然后，将尖头镊的尖端插入巩膜与视网膜之间。

轻轻沿杯缘移动，确保视网膜在任何位置均未与巩膜粘连。在视盘附近剪切，使视网膜完全脱离巩膜。确认视网膜在任何一侧均无与巩膜相连后，缓慢将其推入PBS溶液中。

用镊子将视网膜转移至干净的玻璃载片上，注意避免造成任何损伤。使用显微剪刀或手术刀片，按图示在视网膜上做四个切口，将其分为四个象限。去除视网膜周围多余的PBS，并在视网膜平铺样本上添加抗荧光淬灭封片介质。

用盖玻片覆盖，并在共聚焦显微镜下观察平铺样本。需要注意的是，荧光血管造影的整个过程均需在最低光照条件下进行，以避免FITC-葡聚糖染料的荧光淬灭。在糖尿病大鼠中，视网膜细胞会发生退变，进而导致进一步的并发症。

这些结构改变可通过组织学技术进行观察，以确定视网膜的细胞数量和厚度。在糖尿病大鼠中，由于水肿的存在，视网膜各层的厚度会增加。因此，该技术有助于筛选多种潜在的药理学药物，用于治疗糖尿病视网膜病变。

糖尿病引起的视网膜代谢改变会导致周细胞丢失以及血-视网膜屏障的破坏。由于蛋白质和其他生物分子渗漏进入视网膜和玻璃体，糖尿病大鼠玻璃体中的总蛋白水平升高。阻止血-视网膜屏障的破坏可能显著抑制糖尿病视网膜病变的进展。

在糖尿病视网膜病变中，血管内皮生长因子的表达增加，导致新生血管的形成。这些血管会破坏正常的视网膜结构，因此其神经支配是治疗糖尿病视网膜病变的主要关注点。荧光素血管造影技术可用于观察新生血管以及血管渗漏情况，如上图所示。

然而，只有在糖尿病诱导六个月至十二个月后，血管生成才变得显著。该技术有助于我们量化药物治疗对血管生成神经支配及血管渗漏的影响。糖尿病视网膜病变的未来治疗需要更高效的药理学药物，但只有通过对疾病发病机制的更深入理解，才能实现未来的治疗方法。

掌握这些技术可能有助于研究人员更深入地理解糖尿病视网膜病变的发病机制，从而推动发现更有效的药物干预手段。