可视化细胞骨架依赖性脂质囊泡在 Drosophila 胚胎中的运输

在早期果蝇胚胎中，许多细胞器会进行大规模运动。本方案描述了如何利用为细胞培养开发的荧光染料来监测这种运动。与荧光蛋白相比，市售的荧光探针亮度更高，且光谱覆盖范围更广。

它们可实现多重共标记，并可用于任何遗传背景。掌握胚胎脱水时间需要练习和反复尝试，以避免胚胎在注射时破裂或因过度干燥而停止发育。首先，将毛细管放入拉针仪的毛细管夹持器中，并用蝶形螺母固定，开始制备注射针。

将毛细管的中心与加热元件对齐。根据制造商的说明，在拉针仪上选择合适的设置。使用解剖显微镜进行质量控制检测。

将针头水平插入腻子中，针尖悬于空气中。用盖子盖住针头，存放至使用。使用连接在微量移液器上的针头装载吸头，吸取一微升注射溶液，确保吸头内无气泡。

戴上手套，用一只手握住针头，使其尖端朝外，将上样尖端插入针头中。将液体排放在靠近针头尖端的位置，移出移液器，并垂直持握针头，直至液体流至尖端。用铝箔覆盖容器，注意不要损坏针头尖端，以防止染料褪色。

使用移液管或微量移液器，在矩形盖玻片中央放置一小滴庚烷胶，并使其蒸发。为机械去除卵壳，用一层薄的卤代烃油27覆盖适当年龄的胚胎板，使卵壳变为透明。在解剖显微镜下利用透射光观察胚胎板，确认胚胎发育阶段，并挑选处于卵裂阶段的胚胎。

使用精细镊子夹住目标发育阶段胚胎的背侧附器，将胚胎转移至预先用双面胶带覆盖的载玻片上。将胚胎放置在胶带上，并尽量减少油的转移。用镊子尖端的侧面轻轻推动胚胎，使其在胶带表面缓缓滚动，注意不要直接刺入胚胎。

继续滚动胚胎，直到卵壳粘附在胶带上并出现裂纹。卵壳破裂后，继续滚动胚胎，使其与粘在胶带上的卵壳分离。将胚胎重新滚回到卵壳上，因为卵壳的黏性比胶带低。

用镊子轻轻摩擦胚胎，直到其附着在镊子上以便转移。然后将胚胎转移至盖玻片上，使其与胶水接触以固定胚胎位置，并与镊子分离。调整胚胎在盖玻片上的方向。

将带有胚胎的盖玻片放入干燥室并密封，使胚胎干燥5至12分钟。从干燥室中取出盖玻片，滴加一滴卤代烃油700，覆盖胚胎以防止进一步干燥。在解剖显微镜下观察胚胎，若干燥程度合适，则进行显微注射。

将4X物镜转入光路，使用显微镜上的调焦旋钮调节胚胎至清晰对焦。利用载物台控制装置将胚胎水平移动至视野中央。保持胚胎位于视野边缘，并平移远离，为降低针头做好准备。

保持在同一焦平面上，降低针尖，确保针尖与胚胎同时在视野中可见。通过向卤代烃油700中排出少量注射液来检查针头是否正常工作。若操作成功，针尖附近的油中将出现溶液气泡。

使用载物台控制装置，将胚胎移向针尖，直至针尖轻轻刺入胚胎并进入其内部。同时，开始注入注射溶液，直到针尖位置出现一个短暂的透明区域，表明溶液已成功注入胚胎。使用玻片夹将盖玻片固定在共聚焦显微镜上。

盖玻片易碎，请小心操作。使用共聚焦显微镜的落射荧光功能，配合40倍物镜观察胚胎，并在继续操作前确认胚胎中的Fluoro 4信号可见。进行活体成像时，在合胞体阶段设置图像大小为512 × 512像素，线性平均为3，帧速率为每秒0.1帧。

注入BODIPY 493 503染料后，染料最初定位于针尖插入的位置，随后向注射部位周围扩散。24分钟后，染料已扩散至胚胎中点以外。通过向胚胎注射BODIPY 493 503和LysoTracker Red来监测细胞器的运动性。

粒子图像测速分析显示，胚胎内容物汇聚于胚胎的中央区域，此处细胞质正流入胚胎内部。使用ER-Tracker Green对内质网进行标记，可清晰分辨核膜结构，从而实现对主要细胞周期阶段的可视化观察。在囊胚阶段向胚胎注射MitoView 633，并在四小时后进行成像。

图像显示了处于原肠带伸展阶段的胚胎神经外胚层细胞。将正在细胞化的胚胎注射了BODIPY 493 503和SiR微管蛋白的混合物，结果显示脂滴沿微管双向移动。胚胎必须部分脱水，以便注入液体。

脱水不足会导致注射时胚胎内容物泄漏，脱水过度则会杀死胚胎。通过多种图像分析技术可对细胞器的运动视频进行表征。颗粒追踪技术可揭示单个细胞器的行为，而粒子成像测速法则可揭示整体流动情况。