分离和在转录组水平上分析人原代肠系膜动脉内皮细胞

在转录组水平上表征基因表达对于理解健康和疾病状态下的细胞功能至关重要。我们的方法专注于从人类供体的肠系膜动脉中捕获血管壁关键层——内皮细胞，以进行具有单细胞和空间分辨率的转录组分析。该方法可在无需分选步骤的情况下富集血管来源的内皮细胞群体，从而避免因分选导致的细胞损失。

此外，还存在其他细胞类型，可用于在组织环境中研究细胞间的相互作用。我们已利用该技术研究糖尿病和肥胖症中的动脉变化。根据血管的可获取情况，这些技术还可被重新用于探索其他脉管系统及其他疾病中的生物学过程。

如果是第一次操作，有两个关键步骤需要大量练习：一是刮取，应施加适当力度以去除完整细胞，同时不剥离更深层的组织；二是冷冻切片机切片。

确保切片处于低温、平整状态，并位于特制载玻片的限定范围内。本次操作演示由本实验室的两位博士后研究人员 Yingjun Luo 和 Xiaofang Tang 进行。首先用 DPBS 清洗组织。

使用无菌镊子和解剖剪去除脂肪及外层结缔组织，直至血管洁净。将尺子置于培养皿外侧，测量血管长度，并拍摄记录照片。用剪刀沿纵轴剪开肠系膜动脉，以垂直打开血管腔。

使用针头将血管固定在黑色石蜡的四个角上，暴露内膜。向内膜加入一毫升预热的消化缓冲液。使用无菌手术刀，轻轻刮擦血管管腔两次。

将消化缓冲液转移至离心管中。向内膜中加入1 mL消化缓冲液，轻轻吹打数次以收集剩余细胞，并将细胞悬液转移至离心管中。将细胞置于37°C孵育箱或摇床中孵育5分钟。

加入 M199 培养基至细胞悬液中以终止酶促反应，并轻轻混匀。在 4°C 条件下以 600 × g 离心 5 分钟。离心结束后，移去上清液并单独保存，作为对照培养物，用于观察是否所有细胞均已被收集在沉淀中。随后，将细胞沉淀重新悬浮于 1 毫升 M199 培养基中。

通过将10微升台盼蓝与10微升细胞悬液混合，评估细胞活力。使用血细胞计数板观察细胞形态并进行细胞计数。在室温下，向六孔板的两个孔中各加入500微升包被试剂，孵育30分钟，以完成包被。

用无菌 DPBS 洗涤各孔后，将全部细胞储备液加入一个孔中，上清液作为对照保留并加入第二个孔中。将预先制备的细胞储备液在 4 摄氏度、600 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，用 P-1000 移液器在含 0.04% BSA 的 DPBS 中轻轻重悬沉淀。

充分混匀以确保形成单细胞悬液。将溶液通过40微米细胞筛，去除细胞碎片。然后，离心悬液，并按演示操作弃去上清液。

使用P-1000移液器将沉淀重悬于500微升含0.04% BSA的DPBS中，并充分混匀以确保形成单细胞悬液。如先前所述，使用台盼蓝评估细胞活力。通过血细胞计数板或自动细胞计数仪观察单细胞悬液的形态，检查是否存在组织碎片，并计算活细胞与死细胞的数量。

将异戊烷加入金属罐后，置于液氮或干冰中冷却。将OCT包埋剂倒入已标记的塑料冷冻模具孔中，避免产生气泡。将冷冻模具置于干冰上冷却。

沿血管长度方向至少切割两段一厘米长的冠状切片。使用12英寸镊子将组织浸入异戊烷中直至冻结。迅速将组织浸入OCT包埋剂中，调整方向使管腔居中可见。

将冷冻模具置于干冰上并固定位置，观察其冷冻过程。OCT 从外向内逐渐变白，耗时约一至两分钟。将这些切片存放在密封容器中，于负80摄氏度条件下可保存长达六个月。

设置冰冻切片机腔室和样本头所需的温度。将包埋在OCT中的血管切片、刀片、刷子和载玻片在冰冻切片机中于-20摄氏度平衡约30分钟。在平衡期间，使用70%乙醇清洁可能接触切片的所有设备（包括刀片）及机器，随后用RNase去污染溶液处理。

通过将少量OCT包埋剂滴加到圆形冷冻切片机样本块上，并在包埋剂冻结前将样本放置其上，以固定样本。将样本块置于样本头中心后，使用左侧的黑色长柄旋紧固定。切除血管周围多余的OCT包埋剂。

将冷冻切片机的切片厚度设置为10微米，切取约60个切片，并将其放入含有RNA提取试剂的预冷1.5毫升离心管中。涡旋振荡直至切片完全溶解。按照文稿中所述方法提取RNA，并将纯化后的RNA沉淀溶解于5微升无RN酶的水中。

使用防卷板切出10微米厚的切片。翻转切片，并通过轻轻触碰周围OCT包埋剂的方式小心展平。用乙醇擦拭载玻片，并用手指预热捕获区域的背面。

使用无RNase的冷冻切片机毛刷或直接用载玻片，仅利用周围的OCT包埋剂将组织切片放置于方框内。立即将一根手指按压在捕获区域背面，使切片融化并贴附于载玻片上。一旦切片牢固黏附，即将载玻片置于冷冻条上，使切片重新冻结。

按照先前所述方法，将10微米厚的组织切片切至组织优化或基因表达载玻片上。将载玻片转移至置于干冰上的玻片邮寄盒中。该图显示了使用所述方案培养的分离内皮细胞（ECs），呈现出典型的鹅卵石样形态，且污染细胞极少。

通过免疫荧光检测细胞间连接处，确认了内皮细胞标志物血管内皮钙黏蛋白的表达。约80%的细胞CD31呈阳性，表明人肠系膜动脉内皮细胞构成了新鲜分离细胞群体的大部分。分离失败会导致细胞形态异常，可能表达间充质标志物或伸长呈成纤维细胞样状态。

该图展示了采用本方案对分离的人肠系膜动脉内皮细胞（ECS）进行单细胞RNA测序后，通过均匀流形近似与投影（UMAP）方法获得的代表性聚类结果，其中使用PECAM1和VWF作为标志物，34%的细胞被聚类为内皮细胞（ECs）。高质量的RNA其RNA完整性数值（RIN）应不低于6，且28S与18S核糖体RNA条带的比值应尽可能接近2。当RNA发生降解时，这些核糖体RNA信号可能变弱或消失。

苏木精和伊红染色可显示血管的形态，从而识别出感兴趣区域。基因表达信息通过与苏木精-伊红染色血管的组织空间定位进行可视化。操作组织和细胞样本时需谨慎，以保持RNA质量，尤其是在进行空间转录组分析时。

将组织置于干冰上以减少 RNA 降解。同时，使用预冷的器械操作切片和组织。我们已能够探究内皮细胞基因表达的变化，包括糖尿病背景下长链非编码 RNA（LncRNA）及其与其他细胞类型的相互作用。

我们可以利用空间转录组学分析技术推断出这些转录组变化的位置。