一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的重力驱动经心灌注方法

本方案提供了一种在小鼠中进行固定剂灌注的简单方法，可实现对中枢神经系统组织的组织学研究，且无需大量投入。本文所述重力灌注法的主要优势在于，灌注装置可使用 readily available 组件构建。演示该操作的是陈新杰博士实验室的医学博士生 Arnav Rana。

首先，使用锋利的剃须刀片，将两个500毫升冲洗瓶内部的导管修剪平整，使其与瓶盖螺纹内侧齐平。在每个缓冲液瓶的底部切割一个4厘米×4厘米的方形孔，然后在每个瓶底再切一个小孔，以便插入弯曲的不锈钢微型刮勺。接下来，将微型刮勺弯成S形，使其可用作钩子来悬挂缓冲液瓶。

将弯曲的微型刮勺插入缓冲液瓶的相应开口中。接着，用两根25厘米长的管子分别紧密连接外瓶的吸管出口，并用Y型连接头将这两根管子的末端连接在一起，然后将一根2米长的管子连接到Y型连接头的自由端。从1毫升注射器上取下推杆后，先用剃刀片在距离注射器尖端约6厘米处划痕，然后迅速折断注射器塑料部分。

将注射器的切割面充分插入塑料管的自由端，并确保密封紧密。接下来，将一个缓冲液瓶标记为PFA，另一个标记为PBS。从瓶口起测量约三分之一瓶身长度，在该位置围绕瓶身画一条线，以标示灌注液的适当填充液位。

将一个大号回形针拉直后，弯成一个可环绕管路周长的环形结构，并将此环固定在靠近注射器的管路位置。然后将一块大小合适的泡沫塑料块放入玻璃托盘中，将回形针的两端插入泡沫塑料块内以固定管路，并用纸巾将玻璃托盘前端抬高约2厘米。用蒸馏水冲洗一个1升烧杯后，加入约800毫升18兆欧·厘米的分子生物学级水。将烧杯放入微波炉加热3分钟，或直至水温达到65摄氏度，随后将其放置于通风橱内的加热板或搅拌板上。

接着，用蒸馏水冲洗玻璃棒，并将其放入烧杯中。启动搅拌器，将电热板调至中等加热档位，确保水温不超过70摄氏度。佩戴外科口罩、手套和实验服后，称取40克PFA粉末，加入加热的水中，然后使用移液管向溶液中加入数滴5摩尔的氢氧化钠。

让粉末充分溶解。如果粉末未完全溶解，可根据需要添加更多氢氧化钠。当所有PFA几乎完全溶解后，立即停止搅拌和加热，然后加入100毫升10×PBS，再用18兆欧·厘米的分子生物学级水定容至1升刻度线。

用塑料膜盖住烧杯，并将其放入-20摄氏度的冷冻机中，直至溶液达到室温。使用适当的标准溶液校准pH计后，将烧杯置于搅拌台上，测量溶液的pH值。逐滴加入盐酸，直至pH值达到7.4。

如果pH值过低，加入5摩尔的氢氧化钠以提高pH值。接下来，将真空瓶连接至真空泵，并在瓶口放置一个带有滤纸的洁净陶瓷布氏漏斗。开启真空泵后，使用装有4%PFA溶液的移液管润湿滤纸，然后缓慢将溶液倒入漏斗中的滤纸上，直至所有溶液完成过滤。

过滤后，将溶液置于避光容器中，在 4 摄氏度保存直至使用。在通风橱内，将泡沫塑料解剖板放入玻璃托盘中。确保解剖板上有五到六根短针，用于手术过程中固定小鼠，另需两根长针用于支撑灌注管路。

接下来，用蒸馏水冲洗灌注装置。待所有水排尽后，将灌注瓶悬挂于待灌注动物上方一米处，然后使用分子生物学级水稀释10x PBS，配制非无菌的1x PBS。用止血钳夹闭灌注装置的主线路，再用另一把止血钳夹闭PFA管路。

用 PBS 填充缓冲液容器后，将灌注装置的注射器端放入烧杯中以收集废液，并移除阻断主通路的止血钳。在 PBS 流经管路时，用力轻敲管壁以去除 trapped 的空气。当缓冲液和主通路中的所有空气均被排出后，通过在主通路上夹紧止血钳来阻断液体流动。

接下来，从PFA管路中移除止血钳，使PBS逆向流入PFA瓶中，同时轻弹PFA管路以排出其中的气泡。继续让PBS进入PFA管路，直至在瓶口上方可见液体，然后用止血钳夹闭PFA管路，阻止PBS继续流入PFA瓶。随后，将蝶形输液针连接至灌注注射器，并打开主路止血钳，使PBS流经管路，以排出灌注注射器中的气泡。

气泡去除后，关闭主通路止血钳。确保 PBS 瓶中的 PBS 体积约为其容量的 1/3。如有必要，可通过主通路冲洗 PBS，或向缓冲瓶中添加更多 PBS，直至达到其满容量的 1/3。

当 PBS、PFA 和主线路中的所有气泡均被排尽后，将室温下的 4% PFA 溶液加入 PFA 瓶中，直至液面达到瓶身的黑色标记处。接着，先用清水、再用 70% 乙醇清洁所需器械，以准备非存活性手术。将麻醉后的 C57 black 6J 小鼠固定于泡沫板上后，用皮肤镊提起腹部皮肤，并用大剪刀剪开腹壁，开始手术操作。

继续向上方沿腹部切开至肝脏，然后将肝脏从腹前壁分离，并继续向上方延长初始切口至膈肌。当切口到达膈肌时，使用精细解剖剪在膈肌上打一个小孔，沿小鼠右侧肋骨剪开，约至右侧腋窝的一半位置；随后在膈肌左侧做类似但更长的切口，几乎延伸至左侧腋窝。将胸壁翻折并用针固定于泡沫板上。

确定左心室后，使用精细弯头镊子轻轻夹住心脏以保持稳定，随后打开主路止血钳，使 PBS 流经针头，并立即用针头穿刺左心室。确保针头插入心室的深度不超过 0.5 厘米。接下来，将蝶形导管放置在聚苯乙烯泡沫上由两根较大的 18 号针头交叉形成的 X 形支架上。

辨认下腔静脉从肝脏穿出处，使用精细解剖剪将其剪断。继续用 PBS 灌注，直至从下腔静脉流出的液体无血液成分。随后迅速用止血钳夹闭 PBS 管路，打开 PFA 管路。让 PFA 灌注数分钟，直至小鼠尾部开始卷曲。

一旦尾部开始卷曲，立即启动50分钟计时器。50分钟后，用止血钳夹闭主输液管，并将针头从左心室撤出。随后，将小鼠放入标记好的容器中，置于4摄氏度的PFA溶液中固定过夜。

高质量灌注的标志是肝脏、脊髓和中枢神经系统深部结构中无血液残留。观察到的脑部血液位于颅骨与硬脑膜之间，因此并不影响灌注质量，也不提示灌注效果不佳。采用此灌注方法后检测α-突触核蛋白发现，与表达人源A53T突变型α-突触核蛋白的7月龄无症状小鼠相比，15.5月龄有症状小鼠中磷酸化α-突触核蛋白的累积量显著更高。

该结果与已有报道一致，即这些小鼠脊髓前角和中脑区域存在细胞病理学改变的富集现象。在暴露胸腔时，应注意避免切割任何腹腔器官。此外，灌注针头插入左心室时不可过深。