低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

在本 JoVE 实验方案中，我们采用基于液滴的单细胞核 RNA 测序技术，以解析心脏交感神经元在健康与疾病状态下的生物学结构。该方法能够在一段时间内对大量神经元样本进行测序。通过使用带有标签寡核苷酸（hashtag oligos）标记的细胞核，该技术实现了样本的多重检测。

该方法有望拓展应用于人类神经节神经元的测序，此前这一研究因细胞体积较大以及难以同时采集样本而面临挑战。本实验操作将由本实验室的研究技术员 Conny van Munsteren 和博士生 Lieke van Roon 演示。首先准备好解剖所需的所有材料，然后将小鼠固定在解剖板上。用70%乙醇润湿小鼠，以减少毛发的散落。

使用剪刀沿中线切开颈部皮肤。在体视显微镜下，移开下颌下腺并去除胸锁乳突肌，以暴露颈总动脉及其分叉，以及颈上神经节，并清除附着于其上的组织。分离左右两侧颈总动脉分叉及其附着的组织。

将每一块分离的组织转移至分别盛有冷PBS的3.5厘米培养皿中。找到附着于颈动脉分叉处的颈上神经节。通过去除动脉及附着组织，清洁颈上神经节。

解剖星状神经节时，先在腹部正中线做一切口，随后打开膈肌和腹侧胸壁。先移除肺脏，再取出心脏，以暴露胸腔背侧。在第一肋骨水平，于颈长肌前外侧定位左侧和右侧星状神经节。

用镊子剥离周围组织，解剖双侧星状神经节。将其转移至含有冷PBS的3.5厘米培养皿中。用镊子将上颈神经节和星状神经节分别转移至1.5毫升微量离心管中，然后每管加入500微升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在摇动水浴中孵育。

让神经节沉降至微量离心管底部。将上清液转移至含有5毫升神经节培养基的15毫升离心管中。向微量离心管中加入500微升II型胶原酶溶液，并置于摇动水浴中孵育。

孵育后，用移液器将神经节重悬于胶原酶溶液中，直至检测不到组织团块。将细胞悬液转移至先前使用的含有神经节培养基和胰蛋白酶-EDTA悬液的15毫升离心管中。离心细胞悬液并弃去上清液。

将沉淀重悬于270微升胎牛血清中，并转移至1毫升冻存管。为进行细胞计数，取5微升神经节细胞悬液与5微升0.4%台盼蓝染液混合。将混合液加入血细胞计数板，于显微镜下计数总细胞数和活细胞数。

接下来，向每个冻存管中加入 30 µL 二甲基亚砜，并充分混匀。将冻存管放入细胞冻存盒中，并于 -80 °C 过夜。在 15 mL 离心管上放置孔径 30 µm 的细胞筛，预先准备好。

用1毫升神经节培养基预冲洗滤网。从液氮中取出冻存管，立即在37摄氏度水浴中解冻，直至冻存管中仅剩少量冰粒。向每支冻存管中加入1毫升神经节培养基，同时轻轻振荡冻存管以回收神经节细胞。

将神经节细胞悬液加入过滤器中，并用4至5毫升神经节培养基冲洗。离心过滤后的细胞悬液。弃去上清液，将细胞重悬于50微升细胞洗涤缓冲液中。

将细胞悬液转移至0.5毫升低吸附微量离心管中。离心细胞悬液。此后必须使用配备摆动桶转子的离心机。

离心后，移除上清液45微升，注意不要扰动细胞沉淀。加入45微升预冷的裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，将细胞置于冰上孵育8分钟，然后向每管中加入50微升冷的细胞核洗涤缓冲液。离心细胞核悬液，并移除95微升上清液，注意不要破坏细胞核沉淀。

向沉淀中加入45微升预冷的细胞核洗涤缓冲液，重复离心，并移除上清液。向细胞核沉淀中加入50微升ST-SB，轻轻吹打至细胞核完全重悬，然后加入5微升FC封闭试剂，冰上孵育10分钟。接着，加入1微升单细胞核标签抗体，冰上孵育30分钟。

孵育后，向每根试管中加入 100 微升 ST-SB。离心悬浮液，并在不扰动细胞核沉淀的前提下，移除 145 微升上清液。重复离心操作，并移除上清液。

将细胞核沉淀重悬于50微升ST-SB中，轻轻混匀。取5微升细胞核悬液，与5微升0.4%台盼蓝混合，用于在显微镜下计数细胞核。再次离心细胞核悬液，并将细胞核沉淀重悬于ST-SB中，调整细胞核浓度至每微升1,000至3,000个。

吸取样本以获得所需数量的细胞。文库构建的质量控制分析显示，标签寡核苷酸衍生的cDNA小于180个碱基对。在300至1,000个碱基对范围内出现的宽峰代表高质量的基因表达文库，而194个碱基对处的特异性峰则显示标签寡核苷酸文库。

单细胞核RNA测序分析揭示了12个簇，通过UMAP可视化，哈希标签抗体分布于所有簇中。通过Xist的表达确认了哈希标签寡核苷酸的特异性标记：哈希标签1至4标记女性样本，而5至8标记男性样本。

通过关键转录本验证了测序数据的质量和分辨率，例如在第5和第7簇中用于交感神经元的TH、DBH和SNAP25，在第0至第3簇中用于卫星胶质细胞的S100B，在第4簇中用于内皮细胞的PECAM1，以及在第8簇中用于基质细胞的ACTA2。在尝试该方法时，需注意正确的样品制备以及配备充足的设备，例如精细解剖剪、锋利镊子，以及配有摆动桶转子的离心机，这些均至关重要。这种针对交感性心脏外源性神经节的单细胞核RNA测序逐步操作方法，有望广泛应用于健康与疾病状态下其他相关器官和组织的神经节特征分析。