利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

本方案为研究DNA损伤后复制过程的机制开辟了新的可能性。该技术能够检测与DNA损伤相对应的单链DNA缺口的形成与修复。S1核酸酶可切割单链DNA，从而实现对复制后缺口的检测。

该方法最初由巴西的 Dr.Meneghini 和 Dr.Cordiero-Stone 于 20 世纪 70 年代首次使用，最近我们将其改进并应用于 DNA 纤维实验。利用此处所述技术研究复制后缺口的形成与修复，有助于深入理解维持基因组完整性的 DNA 修复机制及复制应激反应机制。对于本文所描述的 S1 纤维实验和缺口填补实验两种方案，均必须包含所有对照，以确保数据解读的准确性。

该操作将由本实验室的博士生 Davi J. Martins 和曾在我课题组工作期间开发了这些技术的合作者 Annabel Quinet 博士进行演示。首先，吸除培养基，立即向细胞中加入含有 20 微摩尔 IDU 的培养基。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下精确孵育 20 分钟。

随后，用预热的PBS快速洗涤细胞两次，并用20焦耳/平方米的UV-C照射细胞。以未处理的细胞作为对照。立即向细胞中加入含有200微摩尔CldU的培养基，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下精确孵育60分钟。

随后，用预热的 PBS 洗涤细胞两次，并根据细胞系在室温下用 CSK 100 缓冲液处理 2 至 10 分钟以进行透化。经 CSK 透化后，与透化前相比，可见细胞核几乎不含细胞质。洗涤时，小心沿每孔孔壁倾注 PBS，以清洗细胞核。

然后，用S1缓冲液洗涤细胞核。将细胞核分别在含有20单位/毫升S1核酸酶和不含S1核酸酶的S1缓冲液中，于37摄氏度孵育30分钟。接着，吸去S1缓冲液，并加入含0.1% BSA的PBS。

刮取细胞核并将其转移至一个大约标注为1.5毫升的离心管中。始终将离心管置于冰上。在4°C条件下，以约4,600 ×g离心5分钟。

将沉淀重悬于PBS中，浓度约为每微升1,500个细胞。将试管置于冰上，并立即进行DNA纤维制备的铺展操作。用碳素铅笔在显微镜载玻片上做好标记，并将其平放在托盘上。

轻弹管底以确保混匀，取2微升细胞加至相应载玻片顶部。加入6微升裂解缓冲液，上下吹打约5次以裂解细胞。用移液枪头将液滴轻轻向载玻片底部拉动，室温孵育5分钟，以裂解细胞核。

将载玻片倾斜约20至40度，使液滴以恒定的低速扩散至载玻片底部。在室温避光条件下干燥10至15分钟。随后，将载玻片浸入含有新鲜配制固定液的容器中，在室温下孵育5分钟，以将DNA固定在载玻片上。

用 PBS 清洗载玻片两次，每次五分钟，然后在室温下用新鲜配制的 2.5 摩尔盐酸变性 DNA 40 至 60 分钟。用 PBS 清洗载玻片三次，每次五分钟，再在 37 摄氏度下用预先温育的 5% BSA 封闭 30 至 60 分钟。轻轻拍打滤纸以去除载玻片上的多余液体。

将 30 微升一抗以滴加方式加入载玻片，盖上盖玻片。在避光、湿润的室温环境中孵育 1 至 1.5 小时。将载玻片放入盛有 PBS 的染色缸中浸泡 1 至 2 分钟，然后小心移除盖玻片。

用PBST在染色缸中洗涤三次，每次五分钟，然后将玻片置于PBS中。用纸轻轻拍打以去除多余液体，再向玻片上滴加30微升二抗。盖上盖玻片。

在避光湿润的室温环境中孵育45至60分钟。重复洗涤载玻片并除去多余PBS的步骤一次，然后将20微升封片试剂逐滴加至载玻片上。盖上盖玻片，避免产生气泡。

在载玻片顶部细胞裂解位置附近滴加一滴镜油。使用绿色通道，在背景中寻找绿色荧光点以找到焦平面。打开 Leica Application Suite 软件，点击采集（Acquire），并选择绿色通道。

在分析前先调整绿色通道的设置。然后切换至红色通道并调整设置。找到纤维的主要聚集区域，再移动至边缘位置，寻找分布良好、无重叠的单根纤维。

仅使用一个通道选择图片的区域，以避免潜在的偏差。单击“采集叠加”图标，并根据显微镜的正确放大倍数调整软件设置。每张切片在绿光通道下沿整个切片采集约15至20张图像，随后在红光通道下重复采集。

两个通道现已合并，生成的叠加图像被移至一个独立的文件夹中。可以观察到呈红色和绿色的纤维。打开 ImageJ 软件，左键单击第五个图标，选择第二个选项，然后选择“分段线”工具。

单击鼠标左键绘制红色或绿色纤维束的精确路径，单击右键停止绘制。按下键盘上的 M 键以测量长度。对于 S1 纤维，记录每根纤维的红色和绿色纤维束测量值，并从不同图像中至少 150 根纤维测量红色和绿色纤维束的长度。

这些代表性图像显示了一条S1纤维。此处展示的是对照组新生DNA片段，该片段无缺口且对S1核酸酶切割具有抗性。经S1核酸酶切割后呈阳性的含缺口DNA片段导致CldU片段长度变短。

可在文本手稿中广泛描述的差异标记方案用于标记缺口填补事件。在此称为缺口填补检测的实验中，较长的IDU轨迹若至少含有一个CldU斑块或含有较少的CldU斑块，则对应于低密度的缺口填补；而较短的IDU片段（至少含有一个CldU斑块）以及较长的IDU轨迹中含有较多CldU斑块的情况，则对应于高密度的缺口填补。

本方案中的透化步骤对于 S1 核酸酶作用于受损 DNA 复制过程中形成的缺口至关重要。S1 核酸酶也可用于彗星试验方案中，以检测经处理后仍持续存在的受损 DNA 复制过程中所形成的缺口。S1 纤维试验为一种新范式奠定了基础，即复制后缺口可导致癌症脆弱性，特别是在携带 BRCA1 和 BRCA2 基因突变的乳腺癌和卵巢癌中。