小鼠脑实质微动脉内皮细胞的分离与功能分析

该方法将有助于更深入地理解脑实质小动脉内皮的功能，这种功能直接将脑内血流与全脑神经元和胶质细胞活动的能量供应联系起来。与小动脉内皮相比，该技术的一个显著优势在于能够更清晰地分辨单个脑内皮细胞及其各自细胞器的形态学特征，以及钙信号和电信号的传递。最初，脑内皮的分离与观察将极具挑战性。

然而，通过大量练习并保持耐心和专注，是有可能熟练掌握这一技术的。将分离出的大脑置于含有冷解剖液的烧杯或培养皿中进行清洗，以去除大脑表面残留的血液。将腹侧朝上的大脑放入盛有冷解剖液的容器中，以分离脑实质小动脉。

为了分离实质小动脉，将离体脑组织置于含有深度超过50厘米的炭粉浸润硅胶聚合物涂层的培养皿中，在冷解剖液内用钢针固定。使用锋利且对齐的解剖剪，在大脑中动脉（MCA）周围从两侧半球切割出矩形脑组织，确保组织片段的上部已越过大脑动脉环（circle of Willis）的分支点。用钢针将脑组织固定于培养皿中，使大脑中动脉（MCA）朝上。

在针钉附近小心地做一个浅切口，用小镊子去除软脑膜，从一端轻轻剥离至另一端。将带有源自大脑中动脉分支的脑实质小动脉的分离软脑膜小心地用针钉固定于培养皿中，并仔细解剖脑实质小动脉。剪除任何残留的远端分支，确保小动脉干净，无任何附着组织。

使用此清洁完整的微动脉进行酶消化。或者，根据需要可将每根微动脉切成两段，用于酶消化以制备内皮管。对于微动脉段的部分消化，将完整的微动脉段放入含有木瓜蛋白酶、二硫赤藓醇、胶原酶和弹性蛋白酶的10毫升玻璃管中的1毫升解离溶液内。

将小动脉节段在34摄氏度下孵育10至12分钟。为分离小动脉内皮管，将连接微型注射器的吹打移液管置于腔室中的解离溶液内，并靠近消化后的血管节段一端。在泵控制器上设定每秒1至3纳升的流速，进行轻柔吹打。

在保持100倍至200倍放大倍数的同时，将小动脉节段吸入移液管中，然后注入溶液以分离外膜和血管平滑肌细胞。反复吹打血管节段，直至所有平滑肌细胞均被分离，仅剩内皮细胞保持完整的管状结构。使用显微操作器，用硼硅酸盐玻璃固定移液管将内皮管的两端固定在腔室内的玻璃盖玻片上。为测量内皮细胞膜电位，在使用4倍物镜观察时，通过显微操作器小心地将尖锐电极尖端置于小动脉内皮管某一细胞正上方的流动生理盐溶液中。

逐渐将放大倍数增加至400倍，并根据需要重新调整电极尖端的位置。使用显微操作器，将锐利电极的尖端轻轻插入内皮管的一个细胞中，并使用电位计开始记录膜电位（VM）。当内皮细胞静息膜电位稳定在负30至负40毫伏时，根据实验目的施加所需的药理学试剂。

在37摄氏度条件下，用细胞膜或目标细胞器的荧光示踪剂孵育内皮管15至30分钟。用新鲜的灌流生理盐溶液洗涤细胞，并在显微镜下以相应染料的激发波长对活细胞进行成像。通过在37摄氏度条件下检测药理学试剂MTA（一种强效嘌呤能受体激动剂）刺激下细胞内钙离子浓度和膜电位的变化，评估内皮功能。

加入一微摩尔 MTA 后，细胞内钙离子浓度迅速升高，同时伴随膜电位超极化。此外，将完整的内皮细胞在 37 摄氏度下与荧光示踪剂共同孵育，以观察细胞形态。活体内皮细胞成像显示细胞膜和细胞核的共染色。

细胞膜与内质网荧光染料共同染色，使得靠近细胞膜的内质网区域在重叠处呈现橙色。实验人员在解剖和分离过程中应格外小心，避免损伤微动脉，因为受损的微动脉必然无法获得完整的内皮管结构。在完成该操作后，细胞可用于固定后的免疫组织化学染色（使用荧光抗体），或对细胞器及膜脂质进行活细胞染色。

该技术将产生新的信息，有助于从生理学基本层面理解脑血流的机制，并为选择性地向病理状态转变提供治疗依据。