小鼠脑切片上淀粉样蛋白β负荷的全脑与亚区域定量

本方案比较了APP/PS1转基因小鼠脑切片中感兴趣全区域及其亚区域的β-淀粉样蛋白斑块负荷。本方案所介绍的方法与结果将帮助读者或研究人员选择采用感兴趣全区域或感兴趣亚区域分析，以确定小鼠脑切片中的β-淀粉样蛋白负荷。首先，下载图像分析软件。

安装后，启动软件并点击文件，然后打开并选择待分析的图像。从软件工具栏中选择直线工具，在比例尺的长度方向上绘制一条直线。点击分析，然后点击设置比例尺选项卡。

再次点击“分析”（analyze），然后点击“测量”（measure）选项卡，记录比例尺的像素长度或距离。在弹出窗口中，输入以像素为单位的距离、比例尺的实际已知距离，并将长度单位设为微米（micrometer）。如果需要处理多幅图像，请勾选“全局”（global）选项框，以将此新的比例尺设置应用于后续所有图像。

单击“确定”以应用设置。若要将所需测量项设置为该区域的面积，请转到“分析”菜单，然后选择“设置测量”，并勾选“面积”和“显示标签框”。确保在“重定向至”选项卡下列出的待分析图像是已选中的状态。

为便于海马体或皮层的可视化，可调整图像的亮度或对比度。逐渐将最大滑动条向左拖动，以增强组织清晰度，直至可辨识出感兴趣脑区或 ROI。使用多边形或手绘选区工具勾勒海马体区域的轮廓。

划定区域后，点击亮度或对比度设置中的重置选项，以恢复至原始亮度。要测量所选区域的总组织面积，请点击编辑并清除外部区域。当屏幕上仅显示所选区域时，依次点击分析和测量选项卡，即可在弹出窗口中获得分析的总组织面积。

然后，将数据保存为 Excel 文件。要测量 6-E10 染色阳性区域，请依次进入图像的“调整”和“颜色阈值”选项卡。在阈值方法下提供的预设滤镜可突出显示最强信号，使其呈现红色。

选择适当的阈值后，检查暗背景，以在黑色背景下突出显示淀粉样蛋白β斑点。依次点击“选择”、“原始图像”，然后再点击“选择”，从而获得白色背景下淀粉样蛋白β沉积物的暗信号。当弹出窗口出现时，点击“分析”和“分析颗粒”选项卡，然后点击“确定”。通过点击“编辑”和“复制”按钮，复制软件生成的结果摘要。

然后，将数据粘贴到之前创建的 Excel 文件中，并对应相应的标签。使用公式计算 6E-10 阳性区域的百分比。下载图像分析软件后，执行操作步骤，直至脑部 ROI 可被识别，如前所示。接着，使用矩形工具选择皮层或海马中的 ROI。

在工具栏中，单击编辑，然后选择并指定选项卡，将高度和宽度调整为预设值。调整方框，使其完全被组织覆盖。将亮度或对比度重置为原始亮度。

通过右键单击选中的 ROI 区域框并选择“复制”来复制该区域。将打开一个包含所选区域的新窗口。重命名复制的图像以显示其所在区域。

使用工具栏调整复制的图像类型，点击图像后输入 8 位键，将复制的 RGB 图像转换为 8 位，以最佳方式分析斑块。通过点击编辑，然后选择反相，对图像进行反相处理。为测量 6E-10 阳性区域，进入图像后，调整并设置阈值。

在阈值法下使用预定义的滤波器将得到理想结果，最强信号将以红色高亮显示。选择合适的阈值后，点击应用。要分析6E-10阳性区域，请使用工具栏并点击“分析”和“分析颗粒”选项卡，确保勾选“汇总结果”。

单击编辑和复制选项卡，复制包含面积百分比的摘要结果。然后，将摘要结果粘贴到之前创建的 Excel 文件中，并对应相应的标签。对组织中的不同区域重复此操作，确保每个图像之间用于划定 ROI 的方框位置保持一致。

在此代表性评估中，采用全ROI分析法与亚ROI分析法对皮层及海马脑组织中6E-10阳性区域进行定量比较。全ROI分析法需勾画出整个ROI区域，而亚ROI分析法则需在ROI内选择一个预定义的子区域。

此处展示了全视野和子视野 ROI 中 6E-10 阳性区域定量的分步操作流程，其中子视野 ROI 定量包含视野旋转步骤。此处还展示了全视野与子视野 ROI 分析结果之间的相关性。两位阅片者对皮层和海马进行子视野 ROI 分析时，所报告的 6E-10 阳性区域之间均观察到显著的正相关关系。

此外，平均的子ROI中6E-10阳性区域与使用全ROI获得的区域呈强烈的显著正相关。在全ROI分析中，子ROI分析所得的平均6E-10阳性区域在皮层和海马中均未观察到显著差异。通过ELISA检测全脑匀浆液中可溶性淀粉样蛋白β 1-42的测量结果与全ROI分析结果之间也观察到显著相关性。阈值选择是获得准确数据定量的关键。

需要用户干预以确保根据所选滤镜准确选择阳性染色区域。除了淀粉样蛋白β定量外，该方法还可用于其他荧光免疫染色，例如小胶质细胞Iba-1阳性区域的定量分析。