诱导眼表炎症及受累组织的采集

本方案依次描述了诱导眼表炎症及采集与睑板腺功能障碍相关受累器官的步骤。这一新型睑板腺功能障碍（MGD）模型可用于研究该疾病的先天免疫机制，特别是中性粒细胞胞外诱捕网堵塞睑板腺的过程。本方案中展示的技术可进一步扩展应用于临床前阶段的局部治疗干预。

此外，眼部分泌物和器官的采集可反映治疗效果。进行免疫原溶液腹腔注射时，用一只手轻轻抓住7至9周龄C57黑六雌性小鼠的尾巴，并将其固定在笼具网格上。然后用拇指和食指牢固地捏住其背部与颈部区域的皮肤，同时将尾部和后肢固定于无名指和小指与手掌之间。

保持小鼠头部朝下固定，将100微升制备好的免疫原溶液注射至小鼠下腹部腔的右侧或左侧象限。免疫后若需进行眼表攻击，可在麻醉小鼠的每只眼睛上各滴加5微升卵白蛋白（ovalbumin）或ova或生理盐水，然后等待5分钟，使滴入的液体被眼睛吸收。接着，在攻击后立即向眼表滴加50微升无菌生理盐水，收集眼表渗出物。

切除眼表组织时，将小鼠置于平坦的表面上，用70%乙醇棉签消毒眼部周围的眶区。在眼部周围形成切口时，先在耳部与眶后窦之间做一切口，沿鳞状骨上方垂直切开，再沿上颌骨在下眼睑下方水平延伸切口，同时沿额骨在上眼睑上方延伸切口。使用弯头镊子小心夹住眼部周围已分离的组织，将组织连同眼球一起轻轻拉出。

将切除的器官置于无菌 PBS 中。然后在体视显微镜下使用解剖刀修剪切除的上眼睑周围多余的面部肌肉组织。为收集结膜，将上眼睑放置于干燥的培养皿中。

然后使用精细镊子和手术刀，从眼睑内表面轻轻剥离出灰白色黏液层。接下来解剖角膜时，将眼球置于一个新的干燥培养皿中，并将培养皿放在干冰上。三分钟后，将培养皿移至实验台面上，保持稳定放置。

使用精细锋利的剪刀在角膜边缘靠近角膜缘处做一个小切口。接着用手术刀沿眼球继续切开，分离巩膜与角膜。然后用生理盐水充分冲洗角膜后表面，去除虹膜和晶状体残余物。

为了评估睑板腺及其开口，将切除的眼睑置于体视显微镜下并保持直立位置。然后根据相机的曝光时间和 ISO 设置，在白光落射照明下拍摄图像。为了评估睑板腺区域，将切除的眼睑水平放置，并打开配备红外相机的体视显微镜的透射光源。

根据相机 ISO 调整曝光时间以捕获图像。注射生理盐水的小鼠表现出健康的 ocular 表面，眼睛睁得较开。相比之下，ova 应用会引起严重的 ocular 表面炎症、眼睛开口变窄以及水肿迹象。

切除的眼睑显示出大量堵塞物阻塞睑板腺开口，并伴有水肿，而健康眼睑仅显示少量睑板腺分泌物沿睑缘分布。进一步通过红外透照法检查睑板腺，可见其腺泡呈典型的树枝状排列。生理盐水激发小鼠的眼睑则显示出圆形的腺泡结构。

相比之下，卵清蛋白应用诱导了过敏性眼病（AED）中部分腺体的破坏和丧失。眼睑的组织学分析显示，与仅给予生理盐水的小鼠相比，睑板腺出现扩张。将眼球置于干冰上孵育，可在角膜邻近角膜缘处进行切口，并分离角膜与巩膜。

本研究促进了角膜的采集。此外，卵清蛋白给药导致结膜出现严重炎症，表现为充血。在AED小鼠的上清液中，观察到趋化因子CXCL-1水平升高，可促进中性粒细胞外渗、吞噬作用和脱颗粒，以及介导急性期反应和中性粒细胞浸润的白细胞介素-6。

另一方面，白细胞介素-10的浓度在未经处理的小鼠和AED小鼠中均未显示出显著变化。该新模型有助于针对先天免疫通路的药物开发及疗效评估，并对挖掘抗炎药物给药途径的数据具有重要意义。在适当收集器官后，单细胞测序和成像质谱流式细胞术等高度多重化方法均可与本方案兼容。